Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Summary

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Abstract

Een structureel getransformeerd lytische bacteriofagen met een breed gastheerbereik van Staphylococcus aureus-stammen en een penicilline-bindende eiwitten (PBP 2a) antilichaam geconjugeerd latex kralen zijn gebruikt om een biosensor ontwikkeld voor discriminatie van methicilline resistente (MRSA) en gevoelige (MSSA) S creëren . aureus soorten ^1,2. De lytische fagen zijn omgebouwd tot faag spheroids door contact met water-chloroform-interface. Faag spheroïde monolagen werden op een biosensor oppervlak bewogen door Langmuir-Blodgett (LB) techniek ^3. De gecreëerde biosensoren werden onderzocht door een kwartskristalmicrobalans met dissipatie tracking (QCM-D) om bacteriën-faag interacties te evalueren. Bacterie-spheroïde interacties leidden tot lagere resonantiefrequentie en een stijging van de dissipatie energie voor zowel MRSA en MSSA-stammen. Nadat het bacteriële bleken deze sensoren verder blootgesteld aan de penicilline-bindende eiwit antilichaam latex bolletjes. Sensoren geanalyseerd met MRSA gereageerd 2a antilichaam kralen PBP; hoewel sensoren geïnspecteerd met MSSA gaf geen antwoord. Deze experimentele onderscheid bepaalt een ondubbelzinnig onderscheid tussen methicilline resistente en gevoelige S. aureus-stammen. Evenzeer gebonden en ongebonden bacteriofagen onderdrukken de groei van bacteriën op oppervlakken en in het water schorsingen. Zodra lytische fagen worden veranderd in bolletjes, ze behouden hun sterke lytische activiteit en vertonen een hoge bacteriële capture-mogelijkheid. De faag en faag sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen en sterilisatie van antibioticaresistente micro-organismen. Andere toepassingen kunnen het gebruik in bacteriofaagtherapie en antimicrobiële oppervlakken.

Introduction

Methicilline resistente stammen van Staphylococcus aureus zijn gesuggereerd als een factor in essentiële infecties en nosocomiale uitbraken ^4-8. Voorkomende manieren van de erkenning van methicilline resistentie, zoals de disk diffusie oxacillin agar screentest, of bouillon microverdunnings, vertrouwen op maat kweekomstandigheden om de uitdrukking van de weerstand te verbeteren. Veranderingen omvatten het gebruik van oxacilline, incubatie bij 30 of 35 ° C in plaats van 37 ° C, en de toevoeging van NaCl aan het groeimedium. Verder is het voor juiste detectie bij dit soort technieken, een lange incubatietijd van 24 uur in plaats van 16 tot 18 uur vereist. Snelle technieken met de juiste (> 96%) niveau van gevoeligheid voor de identificatie van meticillineresistentie omvatten geautomatiseerde microverdunningsplaten technieken zoals het Vitek GPS-SA-kaart, de Rapid ATB Staphylococcus-systeem, en de Rapid Microscan Panel systeem dat resultaten opleveren na 3-11 uur ^9-11. De Crystal MRSA ID systeem is een snelle methode, gebaseerd op de erkenning van de groei van S. aureus in aanwezigheid van 2% NaCl en 4 mg oxacilline per liter met een zuurstof-gevoelige fluorescentie sensor. Beweerde gevoeligheden variëren tussen 91 tot 100% na 4 uur incubatie ^12-14. Deze fenotypische methoden zijn beperkt in hun nauwkeurigheid door de impact van de heersende stammen die heterogene weerstand uiten. Daarom is de beste algemeen aanvaarde methoden voor de erkenning van methicilline resistentie is PCR of DNA hybridisatie van het mecA gen ^15. Deze techniek vereist echter gezuiverd DNA en is zeer gevoelig voor verschillende hulpstoffen (verontreinigingen) die celresten ¹⁶ omvatten.

Bovendien zijn deze technieken hebben een lange tijd uit te voeren. Strategieën voor de herkenning van het mecA genproduct eiwit PBP 2a, kunnen worden gebruikt om resistentie te bepalen en kan betrouwbaarder vergelijking met standaard testtechnieken ^17.

<p class = "jove_content"> Het was eerder aangetoond dat bacteriofaag 12600 kan gebruikt worden als een erkenning probe voor Staphylococcus aureus stammen inbegrip van die met meticillineresistentie ^1,2,18. In dit werk een nieuwe techniek in de specifieke herkenning en detectie van MRSA, zoals de herkenning van bacteriën met conformatie van MRSA in real time wij voorgesteld. Daarvoor speciaal een S. aureus bacteriofaag met een breed spectrum van systemen (waaronder MRSA) in combinatie met monoklonale antilichamen tegen eiwit (PBP 2a) gebruikt. PBP 2a is een celwand-eiwit en is de oorzaak van antibiotische weerstand van MRSA. Echter PBP 2a antilichaam niet specifiek voor S. aureus omdat sommige andere bacteriën hebben antibiotische bindende eiwitten met sequentie-overeenkomst aan PBP 2a ^19,20. Dus ook in dit werk, S. aureus bacteriofagen en antilichamen tegen PBP 2a eiwit zijn gebruikt. Om een ​​biosensor ontwikkelen specificatisch detecteren en identificeren MRSA een apparaat met een twee stappen is gebruikt. De eerste stap die een S. aureus bacteriofaag monolaag als sensor probe, terwijl de tweede stap gebruikt PBP 2a specifieke antilichamen. Daarom is de eerste stap zal S. herkennen aureus bacteriën, zoals de andere zal gevoelig zijn voor het antibioticum-bindend eiwit. Bij ontvangst van twee stappen signalen positief, duidt de specifieke detectie van MRSA.

Protocol

1. Instellen van het podium Verkrijgen type stam S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicilline-resistente stammen van S. aureus – MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; De lytische faag 12.600. Verkrijgen PBP 2a antilichaam geconjugeerd l…

Representative Results

De faag gedemonstreerd lytische activiteit tegen alle geteste stammen van S. aureus, waaronder MRSA-stammen, zoals aangegeven door de faag spot test. Plaque groottes algemeen varieerden van 5 tot 15 mm. Geen activiteit werd gevonden tegen andere test kweken (tabel 1). Een normale groei van S. aureus ATCC 12600 in NZY middelgrote on shaker-incubator bij 37 ° C is weergegeven in figuur 1A (een curve gemerkt met lege cirkels). Het aantal bact…

Discussion

Het is bekend dat fagen kunnen worden gebruikt als biosensor probes voor bacteriële pathogenen ^28. Het is aangetoond dat dit werk faag met PBP 2a antilichamen kunnen worden gebruikt om het oude probleem: snelle discriminatie antibiotica resistente en gevoelige stammen.

Het bleek echter deze normale ongewijzigde Staphylococcus fagen zijn niet geschikt voor detectie met bacteriën QCM apparaten, hoewel ze bacteriën binden. De faag staart is zo lang dat akoestische golven niet kunn…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools