Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Summary

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

Abstract

Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d'hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces ^de Staphylococcus ^1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l'interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique ^3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d'énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l'anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d'anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l'eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D'autres applications peuvent inclure l'utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Introduction

Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles ^4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d'oxacilline d'agar écran, ou microdilution, s'appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l'expression de la résistance. Les modifications comprennent l'utilisation de l'oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu'à 37 ° C, et l'ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces types de techniques, une longue période d'incubation de 24 heures au lieu de 16 à 18 heures est nécessaire. Techniques rapides avec le niveau approprié (> 96%) de la sensibilité pour l'identification de la résistance à la méticilline comprennent des techniques de microdilution automatisés tels que le Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, et le système de panneau Microscan rapide qui produisent des résultats après 3-11 h ^9-11. The Crystal MRSA système ID est une méthode rapide basée sur la reconnaissance de la croissance de S. aureus, en présence de 2% de NaCl et 4 mg d'oxacilline par litre avec un détecteur de fluorescence sensible à l'oxygène. Sensibilités réclamés varient entre 91 à 100% après 4 h d'incubation ^12-14. Ces méthodes phénotypiques sont limités dans leurs exactitudes par l'impact des souches prévalentes qui expriment la résistance hétérogène. Par conséquent, les méthodes les plus largement acceptée pour la reconnaissance de la résistance à la méticilline est l'hybridation du gène mecA ¹⁵ PCR ou de l'ADN. Cependant cette technique nécessite l'ADN purifié et est extrêmement sensible à divers adjuvants (impuretés), qui comprennent ¹⁶ débris cellulaires.

En outre, ces techniques ont besoin de temps pour réaliser. Stratégies pour la reconnaissance du produit du gène mecA, la protéine PBP 2a, pourraient être utilisés pour déterminer la résistance et peuvent être plus fiable par rapport aux techniques de test standard ^17.

<p class = "jove_content"> Il avait été précédemment montré que bactériophage 12600 peut être utilisé comme une sonde de reconnaissance pour les souches de Staphylococcus aureus, y compris ceux ayant une résistance à la méthicilline ^1,2,18. Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle technique dans la détection et l'identification spécifique de SARM, comme la reconnaissance des bactéries avec conformation du SARM en temps réel. A cet effet, un spécifique S. bactériophage aureus avec un large spectre d'hôtes (y compris les souches de SARM) combiné avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine (PBP 2a) ont été utilisés. PBP 2a est une protéine de paroi cellulaire et elle est la cause de la résistivité de l'antibiotique SARM. Cependant anticorps 2a PBP n'est pas spécifique à S. aureus depuis quelques autres bactéries ont des protéines de liaison aux antibiotiques avec une similarité de séquence PBP 2a ^19,20. Par conséquent, dans ce travail, S. bactériophage aureus et des anticorps contre la protéine PBP 2a ont été utilisées. Pour être en mesure de développer un biocapteur de spécificationquement détecter et identifier SARM un dispositif à deux temps, a été utilisée. La première étape a utilisé un S. aureus bactériophage monocouche en tant que sonde de détection, tandis que la seconde étape utilise PBP 2a anticorps spécifiques. Par conséquent, la première étape comprendra S. la bactérie Staphylococcus, comme l'autre seront sensibles à la protéine antibiotique contraignant. Lorsque les signaux reçus des deux étapes sont positifs, cela indique la détection spécifique de SARM.

Protocol

1. Préparer le terrain Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus – MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600. Obtenir PBP 2a anticorps bi…

Representative Results

Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n'a été trouvée contre les autres-cultures d'essai (tableau 1). Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure …

Discussion

Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes ^28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides.

Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs …

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools