Biosensor for påvisning av antibiotikaresistens resistente Staphylococcus bakterier

Summary

Lytisk phage biosensorer og antistoffkuler er i stand til å diskriminere mellom meticillinresistent (MRSA) og sensitive Staphylococcus bakterier. De phages ble immobilisert ved en Langmuir-Blodgett metoden på en overflate av en kvartskrystall mikrovekt sensor og jobbet så bredt spekter Staphylococcus sonder. Antistoffkuler gjenkjenne MRSA.

Abstract

Et strukturelt transformert lytisk bakteriofag ha en bredde i vertsområde av Staphylococcus aureus-stammer og en penicillin-bindende protein (PBP 2a) antistoff konjugert latekskuler har blitt benyttet for å lage en biosensor beregnet for diskriminering av meticillinresistent (MRSA) og følsom (MSSA) S . aureus arter ^1,2. Lytisk phages har blitt konvertert til fag-sfæroider ved kontakt med vann-kloroform grensesnitt. Phage sfæroide monolayers har blitt flyttet på en biosensor overflate ved Langmuir-Blodgett (LB) teknikk ^tre. Den opprettede biosensorer har blitt undersøkt av en kvartskrystall mikrovekt med utskeielser sporing (QCM-D) for å evaluere bakterier-fag-interaksjoner. Bakterier-sfæroide interaksjoner ført til redusert resonans frekvens og en økning i spredning energi for både MRSA og MSSA stammer. Etter bakteriell binding, har disse sensorene er videre utsatt for penicillin-bindende protein antistoff lateks vulstens. Sensorer som analyseres med MRSA svart på PBP 2a antistoffkuler, selv om sensorer inspisert med MSSA ga ingen respons. Denne eksperimentelle skillet bestemmer en entydig skille mellom meticillin resistente og sensitive S. aureus stammer. Like bundet og ubundet bakteriofager undertrykke bakterievekst på overflater og i vann suspensjoner. Når lytisk phages blir alle forvandlet til sfæroider, beholder de sin sterke lytisk aktivitet og viser høy bakteriell fangst evne. Fagen og phage sfæroider kan benyttes for testing og sterilisering av antibiotikaresistente mikroorganismer. Andre anvendelser kan omfatte bruk i bakteriofag terapi og antimikrobielle overflater.

Introduction

Meticillin resistente stammer av Staphylococcus aureus har blitt foreslått som en faktor i essensielle infeksjoner og nosokomiale utbrudd ^4-8. Vanligste måtene anerkjennelse av meticillin resistens, for eksempel disk diffusjon Oxacillin agar skjermen test, eller kjøttkraft microdilution, er avhengige av skreddersydde kultur vilkår for å forbedre uttrykk for motstand. Endringer omfatter utnyttelse av oksacillin, inkubering ved 30 eller 35 ° C i stedet for 37 ° C, og inkluderingen av NaCl til vekstmediet. Videre, for korrekt deteksjon ved disse typer teknikker, en lang inkubasjonstid på 24 timer i stedet for 16-18 timers er nødvendig. Raske teknikker med passende (> 96%) følsomhet for identifisering av meticillin resistens inkluderer automatiserte microdilution teknikker som Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph system, og Rapid Microscan Panel system som produserer resultater etter 3-11 timer ^9-11. The Crystal MRSA-ID-systemet er en hurtig metode basert på erkjennelsen av veksten av S. aureus i nærvær av 2% NaCl og 4 mg av oksacillin per liter med en oksygen-sensitive fluorescenssensorutstyret. Hevdet følsomhet varierer mellom 91 til 100% etter 4 timer med inkubasjon ^12-14. Disse fenotypiske metoder er begrenset i sine nøyaktigheter ved virkningen av utbredte stammer som uttrykker heterogen motstand. Derfor er de beste mest aksepterte metoder for anerkjennelse av meticillin resistens PCR eller DNA hybridisering av mecA genet ^15. Men denne teknikken krever rensede DNA og er ekstremt følsomme for forskjellige tilsetninger (urenheter), som inkluderer celleavfall ^16..

Videre er disse teknikkene trenger lang tid å utføre. Strategier til anerkjennelse av mecA genproduktet, protein PBP 2a, kunne brukes til å bestemme motstand og kan være mer pålitelig i forhold til standard test teknikker ^17.

<p class = "jove_content"> Det hadde tidligere blitt vist at bakteriofagen 12 600 kan benyttes som en probe for gjenkjennelse Staphylococcus aureus-stammer innbefatter de som har meticillin ^1,2,18. I dette arbeidet foreslo vi en ny teknikk i den spesifikke gjenkjenning og påvisning av MRSA, slik som gjenkjennelse av bakteriene sammen med konformasjon av MRSA i sanntid. For dette formålet en S. aureus bakteriofag med et bredt spektrum av verter (inkludert MRSA stammer) i kombinasjon med monoklonalt antistoff mot protein (PBP 2a) har blitt benyttet. PBP 2a er et cellevegg protein og det er årsaken til antibiotikum resistivitet av MRSA. Men PBP 2a antistoff er ikke spesifikke for S. aureus siden noen andre bakterier har antibiotiske proteiner med sekvenslikhet til PBP 2a ^19,20. Følgelig i dette arbeidet, S. aureus bakteriofag og antistoffer mot PBP 2a proteinet har blitt brukt. For å være i stand til å utvikle en biosensor for å spesifitisk oppdage og identifisere MRSA en enhet med en to-trinns handling har blitt utnyttet. Den første trinnet brukte en S. aureus bakteriofag monolaget som en sensor probe, mens det andre trinnet anvendes PBP 2a spesifikke antistoffer. Derfor går man vil gjenkjenne S. aureus bakterier, vil som den andre være følsomme for antibiotika-bindende protein. Når signaler mottatt fra to trinnene er positiv, betyr det at spesifikk påvisning av MRSA.

Protocol

En. Innstilling av Stage Skaff typestammen S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 og Bacillus subtilis ATCC 6051. Meticillin-resistente stammer av S. aureus – MRSA1, to MRSA, 5 MRSA, 13 MRSA, 26 MRSA, 34 MRSA, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, The lytisk fag 12600. Skaff PBP 2a antistoff konjugert latekskuler. …

Representative Results

Den fag demonstrert lytisk aktivitet mot alle testede stammer av S. aureus, inkludert MRSA-stammer, som indikert av fag stikkprøve. Plakk størrelser generelt varierte fra 5 til 15 mm. Ingen aktivitet ble funnet mot andre test-kulturer (tabell 1). En normal vekst av S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på shaker-inkubator ved 37 ° C er vist i figur 1A (en kurve som er merket med tomme sirkler). Antallet bakterier økte fra 3,2 10 til 6…

Discussion

Det er velkjent at fager kan anvendes som prober for biosensor bakterielle patogener ^28. Det er demonstrert i dette arbeidet som phage sammen med PBP 2a-antistoffer kan anvendes for å løse det gamle problemet: rapid diskriminering antibiotika resistente og sensitive stammer.

Man fant imidlertid de vanlige umodifiserte stafylokokkale fager er ikke egnet for bakterier deteksjon med QCM-enheter, selv om de binder bakterier. Den fag-hale er så lang at akustiske bølger ikke kan «s…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools