Biosensor för detektion av antibiotikaresistenta stafylokocker

Summary

Lytiska fag biosensorer och pärlor antikroppar kan diskriminera mellan meticillinresistenta (MRSA) och känsliga bakterier Staphylococcus. De fager orörlig med en Langmuir-Blodgettmetod på en yta av en kvartskristallmikrovåg sensor och arbetade som breda sonder utbud stafylokocker. Antikropp pärlor erkänner MRSA.

Abstract

En strukturellt transformerad lytisk bakteriofag som har ett brett värdområde av Staphylococcus aureus-stammar och ett penicillin-bindande protein (PBP 2a) antikroppar konjugerade latexpärlor har använts för att skapa en biosensor utformad för diskriminering av meticillinresistent (MRSA) och känsliga (MSSA) S . aureus arter ^1,2. De lytiska fager har omvandlats till fag spheroids genom kontakt med vatten-kloroform gränssnitt. Fag sfäroida monolager har flyttats till en biosensoryta genom Langmuir-Blodgett (LB) teknik ^3. De skapade biosensorer har granskats av en kvartskristallmikrovåg med dissipation tracking (QCM-D) för att utvärdera bakterier-fag interaktioner. Bakterier-sfäroida interaktioner lett till minskad resonansfrekvens och en ökning av försvinnande energi för både MRSA och MSSA stammar. Efter bakteriell bindning, har dessa sensorer varit ytterligare utsatt för penicillin-bindande protein antikropp latexpärlas. Sensorer analyserade med MRSA svarade på PBP pärlor 2a antikroppar, även sensorer inspekterats med MSSA gav inget svar. Denna experimentella distinktion bestämmer en otvetydig diskriminering mellan meticillinresistenta och känsliga S. aureus-stammar. Lika bundna och obundna bakteriofager undertrycka bakterietillväxt på ytor och i vatten upphävanden. När lytiska fager ändras i spheroids, behåller de sin starka lytisk aktivitet och visar hög bakteriell capture kapacitet. Fag och fag sfäroider kan utnyttjas för testning och sterilisering av antibiotikaresistenta mikroorganismer. Andra program kan omfatta användning i bakteriofag terapi och antimikrobiella ytor.

Introduction

Meticillin resistenta stammar av Staphylococcus aureus har föreslagits som en faktor på essentiella infektioner och nosokomiala utbrott ^4-8. Vanliga sätt att erkänna meticillinresistens, såsom disk diffusion oxacillin agar provfilma, eller buljong microdilution, förlita sig på skräddarsydda odlingsbetingelser för att öka uttrycket av motstånd. Förändringar inkluderar utnyttjandet av oxacillin, inkubering vid 30 eller 35 ° C i stället för 37 ° C, och införlivandet av NaCl till tillväxtmediet. Dessutom, för korrekt detektering av dessa typer av tekniker, i stället för 16 och 18 år hr en lång inkubationstid 24 timmar krävs. Snabba metoder med lämplig (> 96%) grad av känslighet för identifiering av meticillinresistens omfattar automatiserade microdilution tekniker såsom Vitek GPS-SA-kortet, Rapid ATB Staph systemet, och Rapid Microscan Panel system som ger resultat efter 3-11 tim ^9-11. The Crystal MRSA ID-system är en snabb metod baserad på erkännande av tillväxt av S. aureus i närvaro av 2% NaCl och 4 mg oxacillin per liter med en syre-känslig fluorescenssensor. Påstådda känslighet varierar mellan 91 till 100% efter 4 h inkubation ^12-14. Dessa fenotypiska metoder är begränsade i sin noggrannhet genom inverkan av vanliga stammar som uttrycker heterogena motstånd. Därför är det bäst allmänt accepterade metoder för erkännande av meticillinresistens PCR eller DNA hybridisering av mecA gen ^15. Men denna teknik kräver renat DNA och är extremt känslig för olika blandningar (föroreningar), som omfattar ¹⁶ cell skräp.

Dessutom är dessa tekniker behöver en lång tid att utföra. Strategier för erkännande av mecA genprodukten, protein PBP 2a, kan utnyttjas för att bestämma resistans, och kan vara mer tillförlitlig jämfört med vanliga testtekniker ^17.

<p class = "jove_content"> Det hade tidigare visat att bakteriofag 12600 kan användas som ett erkännande sond för Staphylococcus aureus-stammar, inklusive de som har meticillinresistens ^1,2,18. I detta arbete har vi föreslagit en ny teknik inom specifika Igenkännande och upptäckt av MRSA, såsom erkännande av bakterier tillsammans med konformation av MRSA i realtid. För detta specifika ändamål ett S. aureus bakteriofag med ett brett spektrum av värdar (inklusive MRSA-stammar) kombinerat med monoklonal antikropp mot protein (PBP 2a) har använts. PBP 2a är en cellvägg protein, och det är orsaken till antibiotikum resistivitet av MRSA. Men PBP 2a-antikroppen är inte specifik för S. aureus eftersom vissa andra bakterier har antibiotiska bindande proteiner med sekvenslikhet PBP 2a ^19,20. Därför i detta arbete, S. aureus bakteriofag och antikroppar mot PBP 2a-protein har använts. För att kunna utveckla en biosensor till specifimatiskt upptäcka och identifiera MRSA en enhet med en tvåstegs åtgärder har utnyttjats. Det första steget används en S. aureus bakteriofag monoskikt som en sensor sond, medan det andra steget användes PBP 2a specifika antikroppar. Därför steg ett kommer att känna igen S. aureus bakterier, kommer som den andra en vara känslig för antibiotikumet-bindande proteinet. När signaler från två stegen är positivt, betyder det att specifikt påvisande av MRSA.

Protocol

Ett. Inställning av scenen Skaffa S. typstam aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 och Bacillus subtilis ATCC 6051. Meticillinresistenta stammar av S. aureus – MRSA1, 2 MRSA, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, Den lytiska fag 12600. Skaffa PBP 2a konjugerad latexpärlor. <l…

Representative Results

Fagen demonstrerade lytisk aktivitet mot alla testade stammar av S. aureus, inklusive MRSA-stammar, såsom indikeras av fagen spot test. Plack storlekar varierade i allmänhet från 5 till 15 mm. Ingen aktivitet återfanns mot andra test-kulturer (Tabell 1). En normal tillväxt av S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på skak-inkubator vid 37 ° C visas i figur 1 A (en kurva märkt genom tomma cirklar). Antalet bakterier ökat från 3,2 x 10 <…

Discussion

Det är väl känt att fager kan användas som biosensordata prober för bakteriella patogener ^28. Det framgår i detta arbete som fag tillsammans med PBP 2a-antikroppar kan användas för att lösa gamla problem: snabba diskriminering antibiotikaresistenta och känsliga stammar.

Man fann emellertid de normala omodifierade stafylokock fager är inte lämpliga för bakterier detektion med QCM-enheter, även om de binder bakterier. Fag-svans är så lång att akustiska vågor inte k…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools