Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Summary

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Abstract

Un bacteriófago lítico estructuralmente transformado que tiene una amplia gama de huéspedes de cepas de Staphylococcus aureus y una proteína de unión a penicilina (PBP 2a) de anticuerpos conjugados con perlas de látex se han utilizado para crear un biosensor diseñado para la discriminación de resistente a la meticilina (SARM) y sensible a la meticilina (SASM) S . especies aureus ^1,2. Los fagos líticos se han convertido en esferoides de fagos por el contacto con la interfase agua-cloroformo. Fagos monocapas esferoide se han movido en una superficie biosensor de Langmuir-Blodgett (LB) Técnica ^3. Los biosensores creados han sido examinados por una microbalanza de cristal de cuarzo con seguimiento de disipación (QCM-D) para evaluar las interacciones bacteria-fago. Interacciones bacteria-esferoide llevaron a la reducción de la frecuencia de resonancia y un aumento de la disipación de la energía, tanto para las cepas de SARM y SASM. Después de la unión bacteriana, estos sensores han sido expuestos más al anticuerpo de proteína de unión a penicilina perla de látexs. Sensores analizados con MRSA respondieron a PBP 2a cuentas de anticuerpos, aunque sensores inspeccionados con SASM dieron ninguna respuesta. Esta distinción experimental determina una discriminación inequívoca entre resistente a la meticilina y S. sensible cepas de Staphylococcus. Igualmente consolidados y no consolidados bacteriófagos suprimen el crecimiento de bacterias en las superficies y en suspensiones de agua. Una vez que los fagos líticos se transforman en esferoides, que conservan su fuerte actividad lítica y muestran una alta capacidad de captura bacteriana. Los esferoides de fago y los fagos se pueden utilizar para la prueba y la esterilización de los microorganismos resistentes a los antibióticos. Otras aplicaciones pueden incluir el uso en la terapia de bacteriófagos y las superficies antimicrobianas.

Introduction

Cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus aureus se han sugerido como un factor en las infecciones esenciales y los brotes nosocomiales ^4-8. Las formas más comunes de reconocimiento de la resistencia a la meticilina, tales como la prueba de difusión en disco oxacilina agar pantalla, o de microdilución en caldo, se basan en las condiciones de cultivo a medida para mejorar la expresión de la resistencia. Las alteraciones incluyen la utilización de oxacilina, incubación a 30 o 35 ° C en lugar de 37 ° C, y la inclusión de NaCl al medio de crecimiento. Por otra parte, para la detección correcta de estos tipos de técnicas, en lugar de 16 a 18 horas se requiere un largo período de incubación de 24 h. Técnicas rápidas con nivel apropiado (> 96%) de la sensibilidad para la identificación de la resistencia a la meticilina incluyen técnicas de microdilución automatizados tales como la tarjeta Vitek GPS-SA, el sistema Rapid ATB Staph, y el sistema Rapid Panel de Microscan que producen resultados después de 3-11 hr ^9-11. El Crystal MRSA sistema de identificación es un método rápido que se basa en el reconocimiento de crecimiento de S. aureus en presencia de 2% de NaCl y 4 mg de oxacilina por litro con un sensor de fluorescencia sensible al oxígeno. Sensibilidades reclamados varían entre el 91 y el 100% después de 4 horas de incubación ^12-14. Estos métodos fenotípicos están limitados en sus exactitudes por el impacto de las cepas prevalentes que expresan resistencia heterogénea. Por lo tanto, los mejores métodos aceptados para el reconocimiento de la resistencia a la meticilina es PCR o hibridación de ADN del gen mecA ^15. Sin embargo, esta técnica requiere ADN purificado y es extremadamente sensible a varias mezclas (impurezas), que incluyen restos de células de ^16.

Además, estas técnicas necesitan mucho tiempo para llevar a cabo. Estrategias para el reconocimiento del producto del gen mecA, proteína PBP 2a, se podrían utilizar para determinar la resistencia y pueden ser más fiable en comparación con las técnicas de ensayo estándar ^17.

<p class = "jove_content"> Se había demostrado anteriormente que bacteriófago 12600 puede ser utilizado como una sonda de reconocimiento para cepas de Staphylococcus aureus incluso los que tienen resistencia a la meticilina ^1,2,18. En este trabajo hemos propuesto una nueva técnica en el reconocimiento específico y la detección de MRSA, tales como el reconocimiento de las bacterias, junto con la conformación de MRSA en tiempo real. Para este propósito específico de una S. bacteriófago aureus con un amplio espectro de huéspedes (incluyendo cepas de SARM) en combinación con el anticuerpo monoclonal contra la proteína (PBP 2a) se han utilizado. PBP 2a es una proteína de la pared celular y que es la causa de la resistividad antibiótico de MRSA. Sin embargo anticuerpo PBP 2a no es específico para S. aureus, ya que algunas otras bacterias tienen proteínas de unión a los antibióticos con secuencia similar a PBP 2a ^19,20. En consecuencia, en este trabajo, S. bacteriófago aureus y anticuerpos contra la proteína PBP 2a se han utilizado. Para ser capaz de desarrollar un biosensor que específicamentecamente detectar e identificar MRSA un dispositivo con una acción en dos etapas se ha utilizado. El paso inicial utilizó una S. aureus monocapa bacteriófago como un sensor de la sonda, mientras que el segundo paso emplea PBP 2a anticuerpos específicos. Por lo tanto, el primer paso será reconocer S. bacteria Staphylococcus, como el otro serán sensibles a la proteína de unión a los antibióticos. Cuando las señales recibidas de los dos pasos son positivos, que indica la detección específica de MRSA.

Protocol

1. Preparando el escenario Obtener la cepa de tipo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 y Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes a la meticilina de S. aureus – MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, 13 MRSA, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; El fago lítico 12600. Obtener PBP 2a anticuerpos conjugados con pe…

Representative Results

El fago demostró actividad lítica contra todas las cepas ensayadas de S. aureus, incluyendo cepas de MRSA, tal como se indica por la prueba de la mancha fago. Tamaños de placa generalmente variaron de 5 a 15 mm. No se encontró actividad contra otros-cultivos de ensayo (Tabla 1). Un crecimiento normal de S. aureus ATCC 12600 en un medio NZY en un agitador-incubador a 37 ° C se muestra en la Figura 1A (una curva marcada por círculos vac…

Discussion

Es bien sabido que los fagos se pueden utilizar como sondas de biosensores para patógenos bacterianos ^28. Se demuestra en este trabajo que fago junto con anticuerpos PBP 2a puede ser utilizada para resolver el viejo problema: las cepas resistentes y sensibles a antibióticos discriminación rápidos.

Se encontró sin embargo esos fagos de estafilococos no modificados normales no son adecuados para la detección de bacterias con dispositivos QCM, a pesar de que las bacterias se un…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools