Biosensor til detektion af antibiotikaresistente Staphylococcus Bakterier

Summary

Lytiske fag biosensorer og antistof perler er i stand til at skelne mellem methicillin resistente (MRSA) og følsomme Staphylococcus bakterier. De fager immobiliseres ved en Langmuir-Blodgett metoden på en overflade af en kvartskrystalmikrovægt sensor og arbejdede som bredspektrede Staphylococcus-prober. Antistof-perler genkende MRSA.

Abstract

Et strukturelt transformeret lytisk bakteriofag med et bredt værtsområde af Staphylococcus aureus-stammer og en penicillin-bindende protein (PBP 2a) antistof konjugerede latexperler er blevet udnyttet til at skabe en biosensor konstrueret til diskrimination af methicillinresistente (MRSA) og følsomme (MSSA) S . aureus arter ^1,2. De lytiske fager er blevet omdannet til fag spheroids ved kontakt med vand-chloroform interface. Fag kugleformede monolag er blevet flyttet over på en biosensor overflade ved Langmuir-Blodgett (LB) teknik ^3.. De oprettede biosensorer er blevet undersøgt af en kvartskrystalmikrovægt med dissipation sporing (QCM-D) for at evaluere bakterier-fag interaktioner. Bakterier-kugleformede interaktioner førte til reduceret resonansfrekvens og en stigning i dissipation energi til både MRSA og MSSA stammer. Efter bakterielle bindende, er disse sensorer er yderligere udsat for penicillin-bindende protein-antistof latexperles. Sensorer analyseret med MRSA reageret på PBP 2a antistof perler, selvom sensorer inspicerede med MSSA gav ingen svar. Denne eksperimentelle skelnen afgør en entydig forskelsbehandling mellem methicillin resistente og følsomme S. aureus stammer. Lige bundet og ubundne bakteriofager undertrykke bakterievækst på overflader og i vand suspensioner. Når lytiske fager ændres til spheroids, de bevarer deres stærke lytisk aktivitet og vise høj bakteriel capture formåen. Fag og fag sfæroider kan anvendes til afprøvning og sterilisering af antibiotikaresistente mikroorganismer. Andre applikationer kan omfatte brug i bakteriofag terapi og antimikrobielle overflader.

Introduction

Methicillin resistente stammer af Staphylococcus aureus er blevet foreslået som en faktor i væsentlige infektioner og nosokomielle udbrud ^4-8. Almindelige måder anerkendelsen af ​​methicillinresistens, såsom disk diffusion oxacillin agar skærmen test, eller bouillon mikrofortyndingsplader, afhængige skræddersyede dyrkningsbetingelser til at forbedre ekspressionen af ​​resistens. Ændringer omfatter udnyttelsen af ​​oxacillin, inkubation ved 30 eller 35 ° C i stedet for 37 ° C, og optagelsen af ​​NaCl til vækstmediet. Desuden er det for korrekt registrering af disse typer af teknikker, en lang inkubationstid på 24 timer i stedet for 16 til 18 år hr er påkrævet. Hurtige teknikker med passende (> 96%) niveau af følsomhed til identifikation af methicillinresistens omfatter automatiserede mikrofortyndingsplader teknikker såsom Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph systemet og Rapid Microscan Panel system, som producerer resultater efter 3-11 hr ^9-11. The Crystal MRSA ID systemet er en hurtig metode, baseret på anerkendelse af væksten i S. aureus i nærvær af 2% NaCl og 4 mg oxacillin per liter med en iltfølsomt fluorescens sensor. Reklamerede følsomheder ligge mellem 91 till 100% efter 4 timer inkubation ^12-14. Disse fænotypiske metoder er begrænsede i deres nøjagtigheder med virkningen af ​​fremherskende stammer, der udtrykker heterogene modstand. Derfor er den bedste bredt accepteret metoder til anerkendelse af methicillinresistens er PCR eller DNA hybridisering af mecA genet ^15.. Men denne teknik kræver oprenset DNA og er yderst følsomt over for forskellige tilsætninger (urenheder), som omfatter celledebris ^16..

Desuden er disse teknikker har brug for en lang tid at udføre. Strategier til anerkendelsen af mecA genproduktet, protein PBP 2a, kan bruges til at bestemme modstanden og kan være mere pålidelige i forhold til standard testteknikker ^17.

<p class = "jove_content"> er tidligere vist, at bakteriofag 12600 kan anvendes som en anerkendelse probe for Staphylococcus aureus stammer, herunder dem der methicillinresistens ^1,2,18. I dette arbejde har vi foreslået en ny teknik i den specifikke genkendelse og sporing af MRSA, såsom anerkendelse af bakterier sammen med konformation af MRSA i realtid. Til dette specifikke formål a S. aureus bakteriofag med et bredt spektrum af værter (herunder MRSA stammer) kombineret med monoklonalt antistof mod protein (PBP 2a) er blevet anvendt. PBP 2a er en cellevæg-protein, og det er årsagen til antibiotikum resistivitet af MRSA. Men PBP 2a antistof er ikke specifik for S. aureus da nogle andre bakterier har antibiotiske proteiner med sekvenslighed med PBP 2a ^19,20. Derfor i dette arbejde, S. aureus bakteriofag og antistoffer mod PBP 2a proteinet er blevet anvendt. At være i stand til at udvikle en biosensor til specifitisk registrere og identificere MRSA en enhed med en to trin er udnyttet. Det første skridt brugte en S. aureus bakteriofag monolag som en sensor probe, mens det andet trin anvendte PBP 2a specifikke antistoffer. Derfor trin man vil genkende S. aureus bakterier, vil som den anden være følsom over for antibiotikummet-bindende protein. Når signaler modtaget fra to trin er positiv, indikerer det specifikke påvisning af MRSA.

Protocol

1.. Indstilling af Stage Opnå typestamme S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 og Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente stammer af S. aureus – MRSA1, MRSA 2, MRSA 5 MRSA 13, MRSA 26 MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, Den lytiske fag 12600. Opnå PBP 2a antistof konjugerede latexperler. …

Representative Results

Fagen viste lytisk aktivitet mod alle testede stammer af S. aureus, herunder MRSA-stammer, som angivet af fag spottest. Plaque størrelser generelt varierede fra 5 til 15 mm. Ingen aktivitet blev fundet mod andre test-kulturer (tabel 1). En normal vækst af S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på rysteinkubator ved 37 ° C er vist i figur 1A (en kurve mærket ved tomme cirkler). Antallet af bakterier steg fra 3,2 x 10 6-4,0 x 10 <s…

Discussion

Det er velkendt, at fager kan anvendes som biosensor prober for bakterielle patogener ^28. Det er påvist i dette arbejde, fag sammen med PBP 2a antistoffer kan anvendes til at løse det gamle problem: hurtige diskrimination antibiotikaresistente og følsomme stammer.

Det konstateredes imidlertid de normale umodificerede stafylokok fager er ikke egnede til bakterier detektion med QCM enheder, selvom de binder bakterier. Fagen hale er så lang, at akustiske bølger ikke kan "n?…

Materials

			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools