قمنا بقياس الافراج عن التوتر في محور عصبي التي تم lesioned جزئيا مع مشرح ليزر من قبل في وقت واحد القياس الطيفي قوة أجريت على اجراء تحقيق بصريا-المحاصرين انضمت إلى غشاء من محور عصبي. بروتوكول التجريبية المتقدمة بتقييم التصاق محوار إلى الركيزة الثقافة.
ويتأثر تشكيل اتصالات وظيفية في شبكة الخلايا العصبية النامية من خلال اشارات خارجية. هو نمو محوار من الخلايا العصبية النامية عرضة للإشارات الكيميائية والميكانيكية، والآليات التي الحواس ويستجيب لإشارات الميكانيكية غير مفهومة جيدا. سوف توضيح دور القوات في نضوج الخلية تمكين تصميم السقالات التي يمكن أن تعزز التصاق الخلايا واقتران هيكل الخلية إلى الركيزة، وبالتالي تحسين قدرة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة لتجديد بعد الاصابة.
هنا، نحن تصف طريقة لتطبيق في وقت واحد قياسات التحليل الطيفي خلال قوة الليزر التي يسببها الآفة الخلية. نقيس الافراج عن التوتر في محور عصبي lesioned جزئيا من خلال تتبع التداخل في وقت واحد من اجراء تحقيق المحاصرين بصريا انضمت إلى غشاء من محور عصبي. لدينا بروتوكول تجريبي بالكشف عن الافراج عن التوتر مع piconewton حساسية، والديناميكية لإطلاق سراح التوتر فيالقرار وقت ميلي ثانية واحدة. ولذلك، فإنه يوفر وسيلة عالية الدقة لدراسة كيفية اقتران الميكانيكية بين الخلايا وركائز يمكن أن يكون عن طريق التضمين العلاج الدوائي و / أو عن طريق الخواص الميكانيكية متميزة من الركيزة.
المجهر الضوئي هو واحد من نظام التصوير أقل الغازية المتاحة لمراقبة الخلايا الحية. مع استغلال تأثيرات مثل ضغط الإشعاع (كما في ملاقط بصرية 1)، أو ذات الطاقة العالية تدفق الفوتون (كما هو الحال في الليزر مشرح 2)، تم تمديد هذه التكنولوجيا لنانو التلاعب. نظام التصوير الضوئي وتقدم لمراقبة دقيقة لتصور والتلاعب أهداف الخلوية الفرعية 3. في الوقت نفسه، وذلك بفضل لمعايرة دقيقة من قوة الليزر تسليمها، أدوات بصرية إنجاز إما لينة أو الغازية التلاعب عينة مع استنساخ لم يسبق لها مثيل.
عدة مختبرات متكاملة، في نفس الإعداد التجريبية، ملاقط بصرية ومشرح الليزر ليجتذ العضيات 4، لتلتحم مع بعضها خلايا مختلفة 5، أو لتحفيز الخلايا عن طريق مدفوعة بصريا الشحنات 6،7. بينما ملاقط بصرية، بعد معايرة لصلابة البصرية، تسمح للسيطرة القوة المطبقة على الخلية على نطاق piconewton، ويمكن لنظم تشريح الليزر تعدل التلاعب البصرية، والتي تتراوح من غشاء الصور poration إلى الاجتثاث من العضيات واحد أو تشريح هياكل شبه الخلوية. ومع ذلك، يعتمد الليزر معايرة تشريح على التقييم النوعي للكيان من التلاعب البصرية فيما يتعلق الطاقة تسليمها إلى عينة، تقوم أساسا على تحليل الصور التي توضح التغيرات المورفولوجية التي لحقت عينة 8. في الطريقة المعروضة، ونحن لشرح كيفية تنفيذ القياس الطيفي قوة أثناء تشريح محور عصبي الليزر من الخلايا العصبية النامية، على القياس، وعلى نطاق وpiconewton، القوة التي ينتجها التوازن تغير في بنية الهيكل الخلوي من حجرة شبه الخلوية 9. الخلايا العصبية مثقف التمسك الركيزة، واستقطاب خلال التنمية. وتحدث هذه المرحلة الاستقطاب خلال الأيام الخمسة الأولى في المختبر. في المرحلة الثانية من الاستقطاب، واحدة من extrudneurites التي جي يصبح أطول، وأنها سوف تفرق أن تصبح محور عصبي 10. استطالة محور عصبي ردا على قوة سحب في مخروط النمو قد صيغت من قبل نموذج Dennerl في 11. في الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد هذا النموذج ليشمل 12 دور التصاق محوار إلى ركائز المصفوفة خارج الخلية. وأظهر هذا النموذج الفيزيائية الحيوية، اقترح بعد الملاحظات التجريبية 13، أن سحب القوات على مخروط النمو، نشر على طول محوار، هي عن طريق التضمين الالتصاقات البؤرية إلى الركيزة. وبالمثل، آفة محور عصبي ينتج الافراج المحلية من التوتر نشر نحو خلايا الجسم. وبالتالي، اقترحنا أن قياس مثل التوتر الذي صدر في مكان على طول محور عصبي بين الآفة وسوما الخلية توفر إمكانية لتقييم نتائج الملطف من الالتصاقات البؤرية تتأثر.
نحن معايرة اللازمة طاقة الفوتون-الجريان للمشرح ليزر للتحكم في مدى ل damag محور عصبي ألحقته، من عانى من قطع كامل للآفة جزئية. بعد المعايرة، كررنا آفة جزئية إلى محاور عصبية من الخلايا العصبية عدة التفريق وضعت بروتوكول لقياس الافراج عن التوتر، وبالتالي الحصول على معلمة الكمي لتقدير التصاق من محور عصبي إلى الركيزة 14.
في العمل الحالي، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول المتقدمة، وهو ما يمثل الإجراء التجريبي دقيقة لتقييم ومقارنة مع piconewton حساسية الالتصاق محور عصبي إلى الركيزة في ظروف تجريبية مختلفة مثل المعالجة الكيميائية 14، أو أنواع مختلفة من الدعم ثقافة الخلية.
نفيدكم في هذا العمل أسلوب كمي لمقارنة التصاق محوار إلى الركيزة ثقافة، في وقت واحد عن طريق إجراء القياس الطيفي قوة الليزر خلال الناجم عن آفة الخلية. ويرتبط الإفراج قياس التوتر لدرجة التصاق الخلية إلى الركيزة: يجب أن الخلايا تحتوي على عدد أكبر من الالتصاقات البؤرية ال?…
The authors have nothing to disclose.
البرتو Guiggiani لتطوير نظام مراقبة الوقت الحقيقي، إيفيلينا Chieregatti وهانكو تسوشيما للمناقشات بصيرة، جياكومو Pruzzo واليساندرو بارودي لتطوير الالكترونيات والبرمجيات المخصصة، وكلوديا Chiabrera ومارينا ناني عن مشورة الخبراء والمساعدة في إعداد ثقافة الخلية.
REAGENTS | |||
Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
EQUIPMENT | |||
IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |