Måling af Tension frigivelse i løbet Laser Induced Axon Læsion at evaluere axonale vedhæftning til underlaget ved Piconewton og millisekund
Summary
Vi målte spænding frigivelse i en Axon der blev delvist læderet med en laser dissektor ved samtidig kraft spektroskopi måling udføres på en optisk fanget sonde klæbet til membranen af Axon. Den udviklede eksperimentelle protokol evaluerer Axon vedhæftning til dyrkningssubstrat.
Abstract
Dannelsen af funktionelle forbindelser i et udviklingsland neuronal netværk er påvirket af udefrakommende signaler. Den neurite væksten i udviklingslandenes neuroner er underlagt kemiske og mekaniske signaler, og de mekanismer, som det sanser og reagerer på mekaniske signaler dårligt forstået. Belyse rollen af kræfter i cellemodning vil gøre udformningen af stilladser, der kan fremme celleadhæsion og cytoskelet kobling til underlaget, og dermed forbedre kapaciteten af forskellige neuronale typer at regenerere efter skade.
Her beskriver vi en metode til at anvende samtidige kraft spektroskopi målinger under laserinduceret cellelæsion. Vi måler spændingen frigivelse i delvis læderede Axon ved samtidig interferometrisk sporing af en optisk fanget sonde klæbet til membranen af Axon. Vores forsøgsprotokol registrerer spændingen udgivelse med piconewton følsomhed og dynamikken i spændingen frigivelsemillisekund tidsopløsning. Derfor, det giver en høj opløsning metode til at undersøge, hvordan den mekaniske kobling mellem celler og substrater kan moduleres ved farmakologisk behandling og / eller ved forskellige mekaniske egenskaber af substratet.
Introduction
Optisk mikroskopi er en af de mindre invasiv billeddannende system til rådighed til at observere levende celler. Med udnyttelse af effekter såsom stråling tryk (som i optisk pincet 1), eller høj-energi fotonflux (som i laser dissektor 2), blev denne teknologi udvidet til nano-manipulation. Det optiske billedsystem fremlægger en præcis kontrol at visualisere og manipulere sub cellulære mål 3.. Samtidig, at præcis kalibrering af den leverede laser magt tak, optiske værktøjer udrette enten blødt eller invasive prøve manipulation med en hidtil uset reproducerbarhed.
Adskillige laboratorier integreret i den samme forsøgsopstilling, optisk pincet og laser dissektoren for at polere organeller 4, at smelte sammen forskellige celler 5, eller at stimulere celler ved optisk drevet laster 6,7. Mens optisk pincet, efter kalibrering af den optiske stivhed, tilladerkontrol af påførte kraft til cellen på en piconewton skala, kan laser dissektion systemer modulere optisk manipulation, som spænder fra membran foto-porering til ablation af enkelte organeller eller dissektion af sub-cellulære strukturer. Men laser dissektion kalibrering afhængig kvalitativ vurdering af den enhed af optisk manipulation med hensyn til energi, der leveres til prøven, hovedsagelig baseret på billedanalyse illustrerer morfologiske ændringer forårsaget til modellen 8.. I det præsenterede metode, viser vi, hvordan du udfører force spektroskopi målinger under laseren axonal dissektion af et udviklingsland neuron, at kvantificere på piconewton skala den kraft der produceres af en ændret balance i cytoskelettet struktur af en sub-cellulært rum 9.. Dyrkede neuroner klæbe til substratet, og polarisere under udvikling. Polariseringen fase opstår i løbet af de første fem dage in vitro. Ved fase to af polarisering, en af extrudING neuritter bliver længere, og det vil differentiere at blive Axon 10. Axonal forlængelse i respons på trækkraft på væksten kegle er tidligere modelleret af Dennerl model 11.. For nylig er denne model blevet udvidet 12 til også at omfatte den rolle neurit vedhæftning til den ekstracellulære matrix substrater. Denne biofysisk model foreslået efter eksperimentelle observationer 13, viste, at trækkræfter på vækst kegle, udbreder sig langs neurit, moduleres ved fokale adhæsioner til underlaget. Ligeledes axonal læsion producerer en lokal frigivelse af spænding formerings mod cellen kroppen. Således har vi foreslået, at måling af sådan frigivet spænding i en placering langs Axon mellem læsionen og den celle soma giver mulighed for at vurdere den afdæmpende resultat af upåvirket fokale adhæsioner.
Vi kalibrerer den nødvendige energi foton-flux af laser dissektoren at styre omfanget af den påførte axonal damage, fra fuldstændig transection til delvis læsion. Efter kalibrering, gentog vi delvis læsion til axoner i flere differentierende neuroner og udviklet protokollen at kvantificere spændingen frigivelse, og således opnåede et kvantitativt parameter at estimere vedhæftning Axon til substratet 14..
I det foreliggende arbejde, beskriver vi i detaljer udviklede protokol, som repræsenterer en præcis eksperimentel procedure for at vurdere og sammenligne med piconewton følsomhed den axonal vedhæftning til underlaget i forskellige eksperimentelle tilstande såsom kemisk behandling 14, eller forskellige typer af cellekultur støtte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer i dette arbejde en kvantitativ metode til at sammenligne den neurit vedhæftning til dyrkningssubstrat, ved at udføre samtidig kraft spektroskopi målt i løbet laserinduceret cellelæsion. Den målte frigivelse af spænding er relateret til graden af adhæsion af cellen til substratet: celler med et højere antal fokale adhæsioner bør frigive mindre spænding. Måling frigivelsen af spænding i form af piconewtons giver en fysisk mængde, som at vurdere axon vedhæftning til kulturen støtte i f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani for at udvikle tidstro kontrolsystem, Evelina Chieregatti og Hanako Tsushima for indsigtsfulde diskussioner, Giacomo Pruzzo og Alessandro Parodi til udvikling af brugerdefinerede elektronik og software, og Claudia Chiabrera og Marina Nanni for deres ekspert rådgivning og bistand i cellekultur forberedelse.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
