Mätning av spänning Release Under Laser Induced Axon skada som Utvärdera Axonal vidhäftning vid Piconewton och millisekundsupplösning
Summary
Vi mätte spänningen release i en axon som var delvis lesion med en laser dissektorn genom samtidig kraft spektroskopi mätningen utförd på en optiskt-fångade proben fäst till membranet av axonet. Den utvecklade experimentella protokollet utvärderar axonet vidhäftning till odlingssubstratet.
Abstract
Bildandet av funktionella anslutningar i en utvecklande neuronala nätverket påverkas av yttre signaler. Den neurite tillväxten i utvecklingsländerna neuroner är föremål för kemiska och mekaniska signaler, samt de mekanismer genom vilka den känner och reagerar på mekaniska signaler förstås dåligt. Belysa betydelsen av styrkorna i cellmognad möjliggör konstruktion av byggnadsställningar som kan främja celladhesion och cytoskelettala koppling till underlaget, och därmed förbättra kapaciteten hos olika neuronala typer att regenerera efter skada.
Här beskriver vi en metod för att tillämpa samtidiga mätningar kraft spektroskopi under laserinducerad cell lesion. Vi mäter spänningen frisättning i den delvis skadade axon genom samtidig interferometrisk spårning av ett optiskt fångade sond fäst vid membranet av axonet. Vår experimentella protokollet detekterar spänningsutlösning med piconewton känslighet och dynamik av spänningen frigivning vidmillisekund tidsupplösning. Därför erbjuder den en hög upplösning metod för att studera hur den mekaniska kopplingen mellan celler och substrat kan moduleras genom farmakologisk behandling och / eller av distinkta mekaniska egenskaperna hos substratet.
Introduction
Optisk mikroskopi är en av de mindre invasiva avbildningssystemet tillgänglig för att observera levande celler. Med utnyttjande av effekter såsom strålning tryck (som vid optisk pincett 1), eller hög energi fotonflöde (som i laser dissekeraren 2), var denna teknik utvidgades till nano-manipulation. Den optiska bildsystem möblerar en noggrann kontroll för att visualisera och manipulera sub cellulära mål 3. Samtidigt, tack vare noggrann kalibrering av levererad laser makt, optiska verktyg åstadkomma antingen mjuka eller invasiva prov manipulation med oöverträffad reproducerbarhet.
Flera laboratorier integrerade, i samma experimentuppställning, optisk pincett och laser dissekeraren i syfte att avlägsna organeller 4, att smälta samman olika celler 5, eller för att stimulera celler genom optiskt driven last 6,7. Medan optisk pincett, efter kalibrering av den optiska styvhet, möjliggörakontroll av applicerad kraft till cellen på ett piconewton skala, kan laser dissektion system modulerar optisk manipulation, som sträcker sig från membranet foto-poration till ablation av enskilda organeller eller dissektion av sub-cellulära strukturer. Men förlitar laser dissektion kalibrering på kvalitativ bedömning av den enhet av optisk manipulation i förhållande till den energi som levereras till provet, främst baserad på bildanalys visar morfologiska förändringar orsakade den förlaga 8. I den presenterade metoden, visar vi hur du utför kraft spektroskopi mätningar under lasern axonal dissektion av en utveckling neuron, att kvantifiera, på piconewton skala, den kraft som produceras av en förändrad balans i cytoskeletonen strukturen av en sub-mobilfack 9. Odlade neuroner vidhäfta till substratet, och polarisera under utvecklingen. Polariseringen fasen inträffar under de första fem dagarna i vitro. I steg två av polarisering, en av extruding neurites blir längre, och det kommer att differentiera bli axonet 10. Axonal töjning som svar på dragkraften på tillväxten konen tidigare har modellerats av Dennerl modell 11. Nyligen har denna modell utvidgats 12 till att omfatta den roll neurite vidhäftning till de extracellulära matrissubstrat. Denna biofysiska modell föreslog efter experimentella observationer 13, visade att dragkrafter på tillväxt kon, som utbreder sig längs den neurite, moduleras av fokala kontakter på substratet. Likaså producerar axonal skada en lokal frisättning av spänning utbreder mot cellen kroppen. Därför föreslog vi att mäta sådan släpps spänningen i ett läge längs axonet mellan lesionen och cellen soma erbjuder möjligheten att bedöma den dämpande resultatet av opåverkade fokala kontakter.
Vi kalibrerar den nödvändiga energin photon-flux av laser dissektorn styra omfattningen av den tillfogade axonal damage, från komplett transection till partiell skada. Efter kalibrering, upprepade vi partiell lesion till axoner av flera differentierande neuroner och utvecklat protokoll för att kvantifiera spänningsutlösning, och sålunda erhållna en kvantitativ parameter för att uppskatta vidhäftningen av axonet till substratet 14.
I föreliggande arbete, beskriver vi i detalj utvecklade protokollet, vilket utgör en exakt experimentella förfarande för att utvärdera och jämföra med piconewton känslighet axonal vidhäftning i olika experimentella betingelser såsom kemisk behandling 14, eller olika typer av cellodling stöd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi redovisar i detta arbete en kvantitativ metod för att jämföra neurite vidhäftning till kulturen substrat, genom att utföra samtidig mätning kraft spektroskopi under laser-inducerad cell lesion. Den uppmätta utsläpp av spänningen är relaterad till graden av vidhäftning av cellen till substratet: celler med ett högre antal fokala sammanväxningar bör släppa mindre spänning. Mäta frisättningen av spänning i form av piconewtons ger en fysisk kvantitet med vilken att utvärdera axonal vidhäftning till k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani för att utveckla det verkliga systemet tidsstyrning, Evelina Chieregatti och Hanako Tsushima för insiktsfulla diskussioner, Giacomo Pruzzo och Alessandro Parodi för utveckling av anpassade elektronik och mjukvara, och Claudia Chiabrera och Marina Nanni för sina expertråd och hjälp i cellkultur beredning.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
Riferimenti
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
