初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降
Summary
蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。
Abstract
自食作用は、特に栄養素の不足、アミノ酸の欠如によって引き起こされる細胞応答である。自食作用は細胞質、長寿命のタンパク質およびタンパク質凝集体であっても、欠陥のある細胞小器官、およびウイルスまたは細菌を隔離ファゴソームと呼ばれる二重膜構造の形成、によって定義される。オートファゴソームは、最終的に細胞質に戻ってリサイクルされる生産の栄養素と、そのコンテンツのバルク劣化につながるリソソームと融合。そのため、オートファジーは、細胞の恒常性のために重要であり、オートファジーの調節不全は、疾患、特に神経変性、老化やがんにつながることができます。
オートファゴソームの形成は、細胞がコアオートファジー機械と呼ばれる、タンパク質の特定のグループを割り当てているため、非常に手の込んだプロセスです。コアオートファジー機械は機能MEMBRANで例えば 、多様な細胞プロセスに関与する付加的なタンパク質によって補完されミトコンドリアとリソソーム生物学におけるe密売、。オートファゴソームの形成と分解のためのこれらのタンパク質の調整はオートファジーの非常にダイナミックで洗練された応答を構成している。ライブセルイメージングは1つが、単一のオートファゴソーム形成のイベントのレベルまで各オートファジー関連タンパク質の分子の寄与を下に従うことができ、リアルタイムで、そのためこの手法は、高い時間·空間分解能を提供しています。
ここでは、我々の分析のための空間的および時間的なコンテキストを確立するために、安定的にGFP-DFCP1を発現する細胞ラインを使用。オートファゴソームの形成につながる前駆構造ですDFCP1マークomegasomes、。目的のタンパク質（POI）は、赤やシアン蛍光タグのいずれかをマークすることができます。ミトコンドリアとリソソームERのような別の細胞小器官は、、、すべてのオートファゴソーム形成の異なるステップに関与しており、特定のトラッカーの染料を使用してマークすることができます。 AUTOPのタイムラプス顕微鏡この実験的なセットでhagyアップ、情報が四次元、 すなわち時間について抽出することができます。したがって、我々は時間と空間にオートファジーにPOIの寄与に従うことができます。
Introduction
自食作用は1-3オートファゴ形成の最終的な結果のために多数のタンパク質の調整を必要とする非常に動的なプロセスである。顕微鏡は、おそらく最も一般的にオートファジー4を研究するための適用手法です。最もファジータンパク質の局在化は、広く両方の内因性タンパク質を免疫染色することによって及び蛍光標識外因性タンパク質の発現により、固定細胞において研究されている。また、電子顕微鏡（EM）、単独および免疫金標識との組み合わせでは、これらの構造5,6の細部を説明した。時間-これらの技術は空間の3次元のオートファゴソーム形成の我々の理解を確立しているという事実にもかかわらず、彼らは4 番目の次元の情報の十分な量を提供するために失敗している。それはpossiとして近くにオートファゴソームの形成に続くことができるようにライブセルイメージングはこの障壁を克服リアルタイム7〜BLE。この技術は、第吉森ら8によってファジーを研究するために用いられ、今後ますます使用されている。
タイムラプス顕微鏡は、生きた細胞内で、一定期間にわたってPOIの局在をキャプチャします。よく特徴付け自食作用および/または細胞小器官マーカーでこの情報を比較することにより、生細胞画像解析は、オートファゴ形成の大きな空間的および時間的文脈でPOIを置くことができる。固定された細胞のイメージングは、単一のキャプチャに基づいていながら、ライブセルイメージング解析は、オートファゴソーム形成のすべてのステップに沿ってPOI定位の繰り返し取り込みに基づいています。固定した細胞のイメージングが同時にlifecyの様々な段階で撮影多くのオートファゴソームにその平均ローカライズに基づいて、POIの役割のみを引き受けることができつつ、ライブセルイメージングは、オートファゴソーム形成の具体的なステップでPOIの貢献を証明することができますCLE。
ライブセルイメージングは、高パワーの分析方法であるが、考慮しなければならないいくつかの固有の限界を有している。まず、生細胞のイメージングは、1つ以上の外因性の蛍光標識タンパク質の発現を必要とする。蛍光タグのサイズは大きくなる傾向があり、彼らは、時には立体的理由のためにタンパク質の挙動を変更することができます。それらは膜の2次元の限られた空間で機能する必要があるとして、この状況は、膜タンパク質に対して強調されている。注目すべきは、オートファゴは膜構造であり、従ってそれらの形成は、膜結合タンパク質を大量に必要とする。
問題の別のセットは、POIの発現レベルに接続されている。原理的には、外因性タンパク質は、内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現されるべきである。これは、そのサブ細胞内局在の重要な調節因子が飽和されないことを保証し、目電子分析は生物学的に関連するようになります。それらは、内因性レベル以上表される場合、それらはファジー応答9を阻害する傾向があるので、さらに、ファジータンパク質の過剰発現は、避けるべきである。 POIの発現レベルは、光退色なしに時間の良い期間の後に、そのローカライゼーションを可能にするのに十分高くなければならないので、逆に、妥協点に到達しなければならない。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の最適な発現レベルを達成するには、微調整の多くを必要とするが、それは安定してPOIのさまざまなレベルを発現する細胞株を確立し、スクリーニングすることによって実現可能である。
標準的な蛍光顕微鏡を用いて達成することができる空間分解能は別の制限要因である。解像度はいくつかの理由のために制限することができるが、最高の状態で、横方向の分解能は250nmで前後になる。これは、これより小さい距離で区切られているオブジェクトが接続されている（または単一として表示されることを意味します250 nmのは、彼らが実際にあるより大きな画像で表現されますよりも小さな物体）とオブジェクト。したがって、画像は常に念頭に置いてこれを解釈されるべきで、そのようなEMなどの補完的な技術は細かい超構造の細部を解決する必要があります。
最後に、生細胞画像化は、本質的に長期間にわたって潜在的に、光に露出させるセルを必要とする。これは、セル、光毒性として知られる現象の生理学的応答を変化させることができる。
我々は正常にオートファゴソームがERストランド10,11と密接に関連しているPI3P豊富なリング状の構造と呼ばomegasomes、由来することを初めて記述するPI3P結合タンパク質DFCP1のライブセルイメージングを使用している。我々は明らかにLC3陽性構造はomegasomesと密接に関連して形成し始めることが示されている。ここ細胞株を用いた生細胞に対して安定GFP-DFCP1を発現することを示唆している目的のタンパク質のイメージングは、オートファゴソーム形成におけるその役割の特性評価のための堅牢な空間および時間枠を確立します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルに記載されている方法は、オートファゴソーム形成の間にタンパク質の局在を可視化することができます。我々は、ポイントスキャン共焦点、スピニングディスクを共焦点と全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査を含む説明イベントを可視化する様々な方法を試してみました。我々は、一般的な目的のために標準の広視野落射蛍光は感度と分解能との間の最良の妥協を提供することを…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの仕事は、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会によってサポートされています。私たちは、親切にCFP-LC3の発現用プラスミドを私達に供給するための教授吉森保に感謝したいと思います。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
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