트립신 다이제스트 프로토콜 마우스 모델의 망막 혈관을 분석하는
Summary
트립신 다이제스트 망막 혈관을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 원고는 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 기술을 최적화하고 비 혈관 조직을 제거 키 변경 등 세부 방법을 설명합니다.
Abstract
트립신 다이제스트는 망막 혈관 1-5 분석하는 황금 표준 방법입니다. 이것은 망막의 비 혈관 구성 요소의 소화 한 후 상호 혈관 채널의 2 차원 평면 마운트를 작성하여 복잡한 3 차원 망막 혈관과 모세 혈관의 전체 네트워크를 시각화 할 수 있습니다. 이것은 하나의 같은 microaneurysms 등 다양한 병리학 적 혈관 변화, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 비율에 비정상적인 내피 세포를 연구 할 수 있습니다. 그러나, 메소드는 때문에 유전자 조작 6,7의 용이성의 망막을 연구하는 데 가장 널리 사용되는 동물 모델이 있고, 특히 생쥐에서, 기술적 도전이다. 마우스의 눈에서는 망막 혈관의 전반적인 구조를 유지하면서 완전히 비 혈관 구성 요소를 제거하는 것이 특히 어렵습니다. 지금까지, 세부 사항에 트립신 다이제스트 기술을 설명 문학의 부족이 난마우스를 명. 또한 어려운 단계의 문제를 해결에 대한 도움말을 제공하는 동안이 원고 마우스 망막에 트립신 다이제스트의 자세한 단계별 방법을 제공합니다.
Introduction
망막의 혈관을 시각화하는 등 당뇨 망막 병증 등 다양한 안과 질환의 메커니즘을 해부하는 매우 중요한 방법입니다. 그것은 하나의 microaneurysms, 모세 혈관 변성 및 혈관 주위 세포 손실 8,9 등 초기 혈관 이상을 평가할 수 있습니다. 지금까지, 망막 혈관을 분석하기 위해 개발 된 여러 가지 기술이 있었다. 다양한 염료의 혈류가 혈관을 강조하기 위해 사용되었지만, 모두 비슷한 한계를 공유했습니다. 선박 1 파열 및 손상 위험이 높은 압력에서 제공하지 않는 주사는 거의 전체 망막 혈관을 강조합니다. 형광 표지 된 G의 B4 isolectin (; I21413, Invitrogen의, 복합 알렉사 플 루어 594 1:100 희석)와 혈관 내피 세포의 면역 염색 및 망막 평면 마운트하면 혈관의 전반적인 구조를 강조하지만, 모세 혈관의 상세한 시각화, 기저막과 혈관 주위 세포없이 할 수 있습니다 . 그것은에 의해 관찰되었다혈관 정기 산 쉬프 (PAS) 또는 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색을 10으로 망막의 평면 마운트 염색에 의해 강조 할 수 Friedenwald. 그러나 염색은 혈관에 비 특이뿐만 아니라 비 혈관 조직을 강조 어려운 혈관을 차별화하고 있습니다. 1960 년대에, 코간와 쿠와 바라보다 쉽게 망막 1 혈관성 구성 요소를 소화하여 망막 혈관을 시각화 한 트립신 다이제스트 기술을 개발했다. 그 이후, 트립신 다이제스트 망막 2-5의 혈관을 분석하는 황금 표준 방법이되었다. 그러나, 그것은 혈관을 분리 할 수있는 다른 대체 기술이 기술되었다 것을주의하는 것이 중요합니다. 삼투 용해의 사용은 혈관을 분리하고 조직 11,12의 생화학 적 연구를 허용하는 데 사용되었지만, 절차는 해부학 적 연구를위한 주요 방법으로 사용되지 않았습니다. 조직의 인쇄 방법은있다미세 혈관의 큰 세그먼트를 분리하는 데 사용하고 혈관 13 electrotonic 구조를 연구 할 수있는 기능을 할 수 있습니다. 이론적으로,이 기술은 또한 혈관의 품질이 높은대로, 해부학 적 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 그것은 단지 혈관의 전체 네트워크 세그먼트를 분리 할 수 있습니다. 이러한 방법 트립신 다이제스트를 대체 할 수 있지만, 그것은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있으며이 점에서 보완하는 것이 중요하다.
트립신 다이제스트 방법은 기술적으로 도전하고 지속적으로 6,7 수행하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 하나의 욕망 망막 6,7의 전체 혈관 구조를 보존하는 경우 특히 트립신 다이제스트, 마우스 모델에 특히 어렵다는 것을 지적하고있다. 과제 요구 (1) 혈관뿐만 아니라 비 혈관 조직 모두의 손실을 일으키는 원인이되는 망막의 이상 소화, (2)에 따라 소화를 포함의 혈관 침대의 손상, 비특이적 염색으로 이어지는 혈관의 비 혈관 조직 (3)별로 분리로 이어질 돌 수 있었다 광범위한 기계적 박리. 몇몇 원고는 이러한 문제를 강조, 그러나 아무도 그들에게 14,15을 극복하기 위해 상세하고 일관된 프로토콜을 제공했다. 이 원고는 특히 어려운 단계를 처리에 대한 구체적인 팁 마우스 및 쥐의 망막에 트립신 다이제스트를 수행하는 방법을 자세히 설명하는 단계별 방법을 소개합니다. 개략도는 그림 1에 표시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
트립신 다이제스트는 망막의 혈관을 평가하는 표준 방법입니다. 불행히도, 기술적으로 도전하고 정확하게 수행이되지 않을 경우, 시료 손실의 높은 비율이 발생할 수 있습니다. 또한, 절차는 안과 질환의 일반적으로 사용되는 유전자 동물 모델에서이 기술의 적용을 제한 할 수있는 마우스에서 특히 어렵습니다. 이 논문은 마우스 눈에 효과적이고 지속적으로 절차를 수행하는 방법에 대한 지침을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 NIH RO1-EY019951 (AAF), 실명 예방 일리노이 학회 (JCC, AAF), 실명 (RPB)를 방지하는 연구에서 안과에 무제한 자금, NY 및 RPB 의료 학생 친목 부여에 의해 지원되었다 (JCC).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
Riferimenti
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