Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell
Summary
Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.
Abstract
Trypsin verdauen ist der Goldstandard Methode, um die retinale Gefäßsystem 1-5 zu analysieren. Es ermöglicht die Visualisierung des gesamten Netzwerks von komplexen dreidimensionalen retinalen Blutgefäßen und Kapillaren, indem eine zweidimensionale Flachbild-Halterung der miteinander verbundenen Gefäßkanäle nach Aufschluss der nicht-vaskulären Komponenten der Netzhaut. Dies erlaubt es, verschiedene pathologische Gefäßveränderungen, wie Mikroaneurysmen Kapillare Degeneration und abnorme Endothelzellen zu pericyte Verhältnisse zu studieren. Allerdings ist das Verfahren technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen, die haben sich die am weitesten verbreitete Tiermodell, um die Netzhaut wegen der Leichtigkeit der genetischen Manipulationen 6,7 studieren. In der Maus Auge, ist es besonders schwierig, vollständig zu entfernen, die nicht-vaskulären Komponenten, während die allgemeine Struktur der Blutgefäße der Netzhaut. Bis heute gibt es einen Mangel an Literatur, die Trypsin verdauen Technik beschreibt im Detail, in die Maus. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methodik des Trypsin Digest in Maus Netzhaut, sondern schafft auch Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.
Introduction
Visualisierung des Gefäßsystems der Netzhaut ist ein äußerst wichtiger Ansatz, um die Mechanismen der verschiedenen Augenkrankheiten wie diabetischer Retinopathie sezieren. Er erlaubt es, die frühesten Gefäßveränderungen, einschließlich Mikroaneurysmen, Kapillar-Degeneration und Verlust pericyte 8,9 bewerten. Bis heute gab es mehrere Techniken entwickelt, um die retinale Gefäßsystem zu analysieren. Perfusion verschiedener Farbstoffe verwendet worden ist, um die Gefäße zu markieren, sondern alle ähnliche Grenzen geteilt. Injection selten hebt die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, es sei denn bei einem hohen Druck, das Aufbrechen und schädigen die Gefäße 1 Risiken gegeben. Immunfärbung von vaskulären Endothel mit fluorophormarkierten G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugierten; I21413; Invitrogen; Verdünnung 1:100) und retinale flachen Halterungen können markieren Sie die gesamte Architektur der Schiffe, aber ohne detaillierte Visualisierung der Kapillaren, Basalmembranen und Perizyten . Es wurde von dem bekanntenFriedenwald, dass die Schiffe durch Färbung Flachbild-Halterungen der Netzhaut mit periodischen acid-Schiff (PAS) oder Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung 10 können hervorgehoben werden. Allerdings war Färbung nicht spezifisch für die Gefäße und markiert die nicht-vaskulären Gewebe sowie, was es schwierig macht, die Gefäße zu unterscheiden. In den 1960er Jahren entwickelt und Cogan Kuwabara das Trypsin zu verdauen Technik, die es einfacher, die retinalen Gefäße durch Verdauen des vaskulären Komponenten der Netzhaut 1 sichtbar gemacht. Seit dieser Zeit hat sich das Trypsin Digest zum Goldstandard-Methode bei der Analyse der Gefäße der Netzhaut 2-5. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere alternative Techniken, um das Gefäß zu isolieren beschrieben wurden. Die Verwendung von osmotischen Lyse wurde verwendet, um die Gefäße zu isolieren und damit biochemische Untersuchungen des Gewebes 11,12, aber das Verfahren ist nicht als primäre Methode anatomischen Studie verwendet. Das Gewebe Druckmethode wurdeverwendet werden, um große Teile der Mikrovaskulatur zu isolieren und ermöglicht die Fähigkeit, die elektrotonischen Architektur des Gefäßsystems 13 zu studieren. Theoretisch könnte diese Technik auch verwendet werden, um anatomische Veränderungen zu untersuchen, wie die Qualität der Gefäße hoch ist. Es ist jedoch nur in der Lage, um Segmente des gesamten Gefäßsystem Netzwerk zu isolieren. Obwohl diese Methoden nicht ersetzen kann Trypsin verdauen, ist es wichtig zu beachten, dass sie unterschiedliche Vor-und Nachteile haben und sind in dieser Hinsicht ergänzen.
Das Trypsin Digest-Methode ist technisch anspruchsvoll und schwierig ist, konsequent 6,7 durchzuführen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Trypsin Digest besonders schwierig ist auf einem Maus-Modell, insbesondere, wenn man wünscht, die gesamte Gefäßarchitektur der Netzhaut 6,7 bewahren. Herausforderungen umfassen (1) über-Verdauung der Netzhaut, Verlust sowohl das Gefäßsystem sowie nicht-vaskulären Gewebe verursacht, (2) unter-Verdauung, erfordernumfangreiche mechanische Präparation wodurch wiederum führen zu Schäden des Schiffes Bett, (3) einer schlechten Trennung des nicht-vaskulären Gewebes aus dem Gefäßsystem zu nicht-spezifischen Färbung. Mehrere Manuskripte haben diese Herausforderungen hervorgehoben, aber keine haben eine detaillierte und konsistente Protokoll vorgesehen, um sie zu überwinden 14,15. Dieses Manuskript wird es eine Schritt-für-Schritt-Methodik detailliert die Technik, um das Trypsin zu verdauen auf Maus und Ratte Netzhaut führen mit speziellen Tipps für den Umgang mit den besonders schwierigen Schritte. Eine schematische Übersicht ist in Fig. 1 gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypsin Digest ist ein Standardverfahren, um die Vaskulatur des Retina zu bewerten. Leider ist es technisch anspruchsvoll und kann in hohen Rate von Probe verloren gehen, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren besonders schwierig in Mäusen, welche die Anwendung dieser Technik bei den üblicherweise verwendeten genetischen Tiermodellen für Erkrankungen des Auges zu begrenzen. Dieses Papier gibt Hinweise, wie das Verfahren effektiv und konsequent durchzuführen, Maus Augen.
<…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Gesellschaft für Verhütung von Blindheit (JCC, AAF), uneingeschränkte Mittel an die Klinik für Augenheilkunde von der Forschung bis Blindness (RPB) Verhindere, NY und RPB Medical Student Fellowship Grants unterstützt (JCC).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
Riferimenti
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