Tripsina Digest protocollo per analizzare la vascolarizzazione della retina di un modello murino
Summary
Tripsina digest è uno dei metodi più comunemente utilizzati per analizzare vascolarizzazione retinica. Questo manoscritto descrive il metodo in dettaglio, comprese le alterazioni fondamentali per ottimizzare la tecnica e rimuovere il tessuto non vascolare preservando l'architettura generale dei vasi.
Abstract
Tripsina digest è il metodo gold standard per analizzare la retina vascolare 1-5. Permette la visualizzazione di tutta la rete di vasi complessi tridimensionali sanguigni e capillari retinici creando una bidimensionale TV a monte dei canali vascolari interconnessi dopo digestione dei componenti non vascolari della retina. Questo permette di studiare le varie alterazioni patologiche vascolari, come microaneurismi, degenerazione capillare e abnorme endoteliali ai rapporti di periciti. Tuttavia, il metodo è tecnicamente impegnativo, soprattutto nei topi, che sono diventati il modello animale più ampiamente disponibile per studiare la retina a causa della facilità di manipolazioni genetiche 6,7. Nell'occhio topo, è particolarmente difficile da rimuovere completamente i componenti non vascolari mantenendo l'architettura complessiva dei vasi sanguigni della retina. Ad oggi, vi è una carenza di letteratura che descrive la tecnica tripsina digest in dettaglio in il mouse. Questo manoscritto fornisce una metodologia dettagliata passo-passo della tripsina digest nel topo retina, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei passaggi difficili.
Introduction
Visualizzare la vascolarizzazione della retina è un approccio estremamente importante per sezionare i meccanismi delle varie malattie oculari come la retinopatia diabetica. Essa permette di valutare le prime anomalie vascolari, tra cui microaneurismi, degenerazione dei capillari, e perdita pericyte 8,9. Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la vascolarizzazione della retina. Perfusione di vari coloranti è stato utilizzato per evidenziare i vasi, ma tutti hanno condiviso limitazioni simili. Iniezione evidenzia raramente l'intero sistema vascolare della retina a meno dato ad alta pressione, che rischia di rompersi e danneggiare le navi 1. Immunostaining dell'endotelio vascolare con fluoroforo marcato G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 coniugato; I21413, Invitrogen; diluizione 1:100) e monta piatti della retina può evidenziare l'architettura complessiva dei vasi, ma senza la visualizzazione dettagliata di capillari, membrane basali e periciti . È stato osservato dallaFriedenwald che le navi possono essere evidenziate dalla colorazione piatta-monti della retina con acido periodico di Schiff (PAS) o ematossilina ed eosina (H & E) colorazione 10. Tuttavia, la colorazione era non-specifico ai vasi ed evidenziato il tessuto non vascolare pure, rendendo difficile distinguere i vasi. Nel 1960, Cogan e Kuwabara sviluppato la tecnica tripsina digest che ha reso più facile visualizzare la vascolarizzazione della retina da digerire componenti non vascolari della retina 1. Da quel momento, la tripsina digest è diventato il metodo gold standard nell'analisi della vascolarizzazione della retina 2-5. Tuttavia, è importante notare che altre tecniche alternative per isolare il sistema vascolare sono stati descritti. L'uso di lisi osmotica è stato usato per isolare il sistema vascolare e consentire studi biochimici del tessuto 11,12, ma la procedura non è stata utilizzata come metodo primario per studio anatomico. Il metodo di stampa dei tessuti è statautilizzato per isolare ampi segmenti microcircolo e permette la capacità di studiare l'architettura elettrotoniche del sistema vascolare 13. In teoria, questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti anatomici, come la qualità dei vasi è elevata. Tuttavia, è solo in grado di isolare segmenti della intera rete vascolare. Sebbene questi metodi non possono sostituire tripsina digest, è importante notare che essi hanno diversi vantaggi e le carenze e sono complementari a questo riguardo.
Il metodo digest tripsina è tecnicamente impegnativo e difficile da eseguire in modo coerente 6,7. Inoltre, è stato notato che la tripsina digest è particolarmente difficile in un modello di topo, in particolare quando la si vuole preservare l'architettura complessiva vascolare della retina 6,7. Sfide includono (1) sopra-digestione della retina che causa la perdita sia del sistema vascolare così come il tessuto non vascolare, (2) sotto-digestione, richiedendodissezione estesa meccanico che porterebbe al danneggiamento del letto recipiente, (3) scarsa separazione del tessuto non vascolare dalla vascolatura conseguente colorazione aspecifica. Diversi manoscritti hanno evidenziato queste sfide, ma nessuno ha fornito un protocollo dettagliato e coerente per superarli 14,15. Questo manoscritto introdurrà una metodologia step-by-step dettaglio la tecnica per eseguire la tripsina digest su topo e ratto retine con consigli specifici su come gestire i passaggi particolarmente difficili. Una panoramica schematica è mostrata in Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tripsina digest è un metodo standard per valutare la vascolarizzazione della retina. Purtroppo è tecnicamente impegnativo e può causare elevato tasso di perdita di campione, se non eseguite correttamente. Inoltre, la procedura è particolarmente difficile nei topi, che può limitare l'applicazione di questa tecnica nei comunemente utilizzati modelli animali genetici di malattie oculari. Questo documento fornisce una guida su come eseguire la procedura efficace e coerente con gli occhi del mouse.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Società per la Prevenzione della Cecità (JCC, AAF), i fondi non vincolati al Dipartimento di Oftalmologia di ricerca per prevenire la cecità (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship di Grant (CCM).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
Riferimenti
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
