Trypsin Digest protokollen til Analyser Retinal blodkar av en mus modell

Summary

Trypsin fordøye er en av de mest brukte metodene for å analysere retinal blodkar. Dette manuskriptet beskriver metoden i detalj, inkludert viktige endringer for å optimalisere teknikken og fjerne ikke-vaskulære vev samtidig bevare den generelle arkitekturen av skipene.

Abstract

Trypsin fordøye er gullstandarden metode for å analysere retinal blodkar ^1-5. Den tillater visualisering av hele nettverket av komplekse tredimensjonale retinale blodkar og kapillærer ved å skape en todimensjonal flate-montering av de sammenkoblede vaskulære kanaler etter oppslutning av de ikke-vaskulære komponenter av netthinnen. Dette gjør det mulig å studere ulike patologiske vaskulære endringer, for eksempel microaneurysms, kapillær degenerasjon og unormal endotelceller til pericyte forholdstall. Imidlertid er fremgangsmåten teknisk krevende, særlig hos mus, som er blitt den mest tilgjengelige dyremodell for å studere retina på grunn av den enkle genetiske manipulasjoner ^6,7. I mus øyet, er det spesielt vanskelig å fjerne ikke-vaskulære komponenter og samtidig opprettholde den generelle arkitekturen av de retinale blodkar. Til dags dato, er det en mangel på litteratur som beskriver trypsin fordøye teknikken i detalj in musen. Dette manuskriptet gir en detaljert steg-for-trinn metode for trypsin fordøye i mus netthinnen, samtidig gir tips om feilsøking vanskelige trinn.

Introduction

Visualisere blodkar i netthinnen er en ekstremt viktig tilnærming for å dissekere mekanismene for ulike øyesykdommer som diabetisk retinopati. Det gjør det mulig å vurdere de tidligste karlidelser, inkludert microaneurysms, kapillær degenerasjon, og pericyte tap ^8,9. Hittil har det vært flere teknikker utviklet for å analysere retinal blodkar. Perfusjon av ulike fargestoffer har blitt brukt til å markere skipene, men alle har delt samme begrensninger. Injeksjon fremhever sjelden hele retinal blodkar mindre gitt på et høyt trykk, som risikerer sprekker og skader på skipene ^en. Farging av blodåreendotelets med fluorophore-merket G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugert; I21413, Invitrogen, 1:100 fortynning) og netthinnens flate mounts kan markere den generelle arkitekturen av skipene, men uten detaljert visualisering av kapillærene, kjelleren membraner og pericytes . Det ble bemerket avFriedenwald at fartøy kan bli markert ved farging flat-beslag av netthinnen med periodiske syre-Schiff (PAS) eller hematoxylin og eosin (H & E) farging ^10. Imidlertid var flekker uspesifikk til skipene og fremhevet den ikke-vaskulære vev i tillegg, noe som gjør det vanskelig å skille skipene. I 1960, utviklet Cogan og Kuwabara trypsin fordøye teknikk som gjorde det lettere å visualisere retinal blodkar ved å fordøye de nonvascular komponentene i netthinnen ^en. Siden den gang har trypsin fordøye blitt gullstandarden metode i å analysere blodkar i netthinnen ^2-5. Det er imidlertid viktig å merke seg at andre alternative teknikker for å isolere blodkar er blitt beskrevet. Bruken av osmotisk lysering har blitt brukt for å isolere blodkar og tillate biokjemiske studier av vevet ^11,12, men fremgangsmåten er ikke benyttet som en primær fremgangsmåte for anatomisk undersøkelse. Vevet print metoden har værtanvendt for isolering av store segmenter av mikrosirkulasjon og tillater evnen til å studere den electrotonic arkitekturen av vaskulaturen ^13.. I teorien kunne denne teknikk også anvendes til å studere anatomiske forandringer, som kvaliteten av fartøyene er høy. Det er imidlertid bare i stand til å isolere deler av blodkar hele nettverket. Selv om disse metodene ikke kan erstatte trypsin fordøye, er det viktig å merke seg at de har forskjellige fordeler og svakheter, og er komplementære i denne forbindelse.

Det trypsin-digest metoden er teknisk krevende og er vanskelig å utføre gjennomgående ^6,7. Videre har det blitt bemerket at trypsin digest er spesielt vanskelig på en musemodell, særlig hvis man ønsker å bevare den totale vaskulær arkitekturen av netthinnen ^6,7. Utfordringene omfatter (1) over-fordøyelse av retina som forårsaker tap av både blodkar samt ikke-vaskulært vev, (2) under-fordøyelse, som kreveromfattende mekanisk disseksjon som igjen kan føre til skader på fartøyet sjikt, (3) dårlig separering av den ikke-vaskulære vev fra det vaskulære karet som fører til ikke-spesifikk farging. Flere manuskripter har fremhevet disse utfordringene, men ingen har gitt en detaljert og konsistent protokollen for å overvinne dem ^14,15. Dette manuskriptet vil innføre en trinn-for-trinn metode detaljering teknikk for å utføre trypsin fordøye på mus og rotter netthinne med konkrete tips om håndtering av spesielt vanskelige trinn. En skjematisk oversikt er vist i figur 1..

Protocol

En. Retinal Forberedelse Enucleate musen øyet. Ved hjelp av en hånd, åpnes øyelokkene, slik at øyet er synlig. Med den andre hånden, ved hjelp av en buet pinsett (buede vendt oppover), press på øvre og nedre sider av den bane inntil jordkloden stikker. Lukk forsiktig tang ved den bakre del av øyet og løft i en kontinuerlig bevegelse til enucleate øyet. Fix øyet med 10% nøytral bufret formalin i minst 24 timer. Plasser øye i PBS-løsning i en liten petriskål. Dissek…

Representative Results

Det endelige produkt av en vellykket prosedyre er en flat-montering av hele nettverket av musen retinal vaskulatur, med arkitekturen opprettholdt, farget med PAS / hematoxylin eller H & E, som vist i figurene 2-4. Klar differensiering av endoteliale celler og pericytes kan sees som vist i figur 3.. I netthinnen kjerner av endotelcellene er oval eller langstrakt og ligge helt innenfor karveggen. Pericyte atomkjerner er små, kuleformede, beis tett og generelt har en utstående stilli…

Discussion

Trypsin digest er en standard metode for å vurdere vaskulatur av netthinnen. Dessverre er det teknisk utfordrende og kan resultere i høye frekvensen av prøven tap dersom ikke riktig utført. Videre er fremgangsmåten spesielt vanskelig i mus, noe som kan begrense anvendelsen av denne teknikk i vanlig brukte genetiske dyremodeller av øyesykdommer. Denne artikkelen gir veiledning om hvordan du skal utføre prosedyren effektivt og konsekvent i mus øyne.

Det er flere viktige skritt i protok…

Materials

			REAGENTS
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4
Trypsin (1:250)	Amresco	0458-50G	Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
			EQUIPMENT
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors	Fine Science Tools	15024-10	Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox)	Dumont #5	11252-20	Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator	Precision Scientific	BDG59442	Shaker optional
24-well dish	Falcon	353047
Microscope Slides	VWR	82027-132