Kolonisering av murin nasopharynx med Streptococcus pneumoniae och efterföljande extraktion av vidhäftande eller rekryterade celler beskrivs. Denna teknik innebär att spola nasopharynx och insamling av vätskan genom nares och är anpassningsbar för olika avläsningar, inklusive differentialcell kvantifiering och analys av mRNA uttryck in situ.
Nasopharyngeal kolonisering av Streptococcus pneumoniae är en förutsättning för invasion till lungorna eller blodomloppet1. Denna organism kan kolonisera nasofarynxens slemhinna, där den kan bo, multiplicera och så småningom övervinna värdförsvar för att invadera till andra vävnader i värden. Etablering av en infektion i de normalt nedre luftvägarna resulterar i lunginflammation. Alternativt kan bakterierna spridas i blodomloppet som orsakar bakteriemi, vilket är förknippat med högdödlighet 2, eller annars leda direkt till utvecklingen av pneumokockhinneinflammation. Att förstå kinetiken i och immunsvar på nasopharyngeal kolonisering är en viktig aspekt av S. pneumoniae infektion modeller.
Vår musmodell av intranasal kolonisering är anpassad från mänskligamodeller 3 och har använts av flera forskargrupper i studien av värdpatogena svar i nasopharynx4-7. I den första delen av modellen använder vi ett kliniskt isolat av S. pneumoniae för att upprätta en självbegränsande bakteriell kolonisering som liknar transporthändelser hos mänskliga vuxna. Förfarandet som beskrivs häri innebär beredning av en bakteriell inokulat, följt av upprättandet av en kolonisering händelse genom leverans av inokulat via en intranasal administreringsväg. Bosatta makrofager är den dominerande celltypen i nasopharynx under steady state. Vanligtvis finns det få lymfocyter närvarande hos oinfekterade möss8, men slemhinnor kolonisering kommer att leda till låg till höggradig inflammation (beroende på bakteriearternas och stammens virulens) som kommer att resultera i ett immunsvar och efterföljande rekrytering av värd immunceller. Dessa celler kan isoleras av en lavage av trakealinnehållet genom narerna och korreleras till koloniseringsbakteriernas densitet för att bättre förstå infektionens kinetik.
I denna studie presenterade vi detaljerade metoder för intranasal kolonisering av möss med hjälp av en klinisk isolate stam av Streptococcus pneumoniae och efterföljande isolering och karakterisering av immunceller rekryteras till nasopharynx som svar på bakterierna. Vi visade hur ett bakteriellt inokulat kan odlas i näringsrika medier och användas för att etablera en koloniseringshändelse hos möss, som ursprungligen är begränsad till nasofarynx. Vi visade sedan hur svara immun cell typer som rekryte…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr. Jeffery Weiser vid University of Pennsylvania för hans gåva av de kliniska stammarna av Streptococcus pneumoniae. Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research. CV finansierades av ett M. G. DeGroote-stipendium och ett stipendium från Canadian Thoracic Society. Detta arbete finansierades av Ontario Lung Association och Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbetet i Bowdish-laboratoriet stöds delvis av michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research och McMaster Immunology Research Centre.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Anti-Mouse Ly6C FITC | BD Pharmingen | 553104 | |
Anti-Mouse Ly6G PE | BD Pharmingen | ||
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 | eBioscience | 48-0453-82 | |
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC | eBioscience | 17-4801-82 | |
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-0114-82 | |
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 | eBioscience | 25-0112-82 | |
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0032-82 | |
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC | eBioscience | 93-0041-42 | |
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
BD 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
BD 26G3/8 Intradermal Bevel | Becton Dickinson | 305110 | |
Buffer RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Difco Tryptic Soy Agar | Becton Dickinson | 236950 | |
Defibrinated Sheep Blood | PML Microbiologicals | A0404 | |
RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
M-MuLV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0253L | |
GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 |