JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Published: January 17, 2014
doi:
10.3791/50490
, , ,
1Department of Pathology and Molecule Medicine,McMaster University

Summary

Kolonisering av murin nasopharynx med Streptococcus pneumoniae och efterföljande extraktion av vidhäftande eller rekryterade celler beskrivs. Denna teknik innebär att spola nasopharynx och insamling av vätskan genom nares och är anpassningsbar för olika avläsningar, inklusive differentialcell kvantifiering och analys av mRNA uttryck in situ.

Abstract

Nasopharyngeal kolonisering av Streptococcus pneumoniae är en förutsättning för invasion till lungorna eller blodomloppet1. Denna organism kan kolonisera nasofarynxens slemhinna, där den kan bo, multiplicera och så småningom övervinna värdförsvar för att invadera till andra vävnader i värden. Etablering av en infektion i de normalt nedre luftvägarna resulterar i lunginflammation. Alternativt kan bakterierna spridas i blodomloppet som orsakar bakteriemi, vilket är förknippat med högdödlighet 2, eller annars leda direkt till utvecklingen av pneumokockhinneinflammation. Att förstå kinetiken i och immunsvar på nasopharyngeal kolonisering är en viktig aspekt av S. pneumoniae infektion modeller.

Vår musmodell av intranasal kolonisering är anpassad från mänskligamodeller 3 och har använts av flera forskargrupper i studien av värdpatogena svar i nasopharynx4-7. I den första delen av modellen använder vi ett kliniskt isolat av S. pneumoniae för att upprätta en självbegränsande bakteriell kolonisering som liknar transporthändelser hos mänskliga vuxna. Förfarandet som beskrivs häri innebär beredning av en bakteriell inokulat, följt av upprättandet av en kolonisering händelse genom leverans av inokulat via en intranasal administreringsväg. Bosatta makrofager är den dominerande celltypen i nasopharynx under steady state. Vanligtvis finns det få lymfocyter närvarande hos oinfekterade möss8, men slemhinnor kolonisering kommer att leda till låg till höggradig inflammation (beroende på bakteriearternas och stammens virulens) som kommer att resultera i ett immunsvar och efterföljande rekrytering av värd immunceller. Dessa celler kan isoleras av en lavage av trakealinnehållet genom narerna och korreleras till koloniseringsbakteriernas densitet för att bättre förstå infektionens kinetik.

Protocol

Innan du börjar: alla steg görs i ett biohazard nivå 2 (BSL2) biologiskt säkerhetsskåp (BSC) om inget annat anges. Se till att du har erhållit lämpligt biohazardgodkännande för användning av infektiösa bakteriella patogener enligt institutionella riktlinjer innan experimenten inleds. Se dessutom till att du har alla material och reagenser som krävs för att genomföra proceduren i förväg. Möss som används i dessa experiment har inkluderat kvinnliga C57BL/6 möss från Jackson Laboratories…

Representative Results

Figur 1 representerar en översikt schematisk sammanfattning av protokollets huvudsteg. Figurerna 2-3 ger visualisering av den mikrobiologiska metodik som är inneboende i de protokoll som beskrivs häri. Figur 4 representerar korrekt positionering av en mus för att utföra en intranasal kolonisering, medan figur 5 visar typiskt förändringar i vikt hos möss koloniserade med S. pneumoniae stam P1547. Figurerna 6-7 representer…

Discussion

I denna studie presenterade vi detaljerade metoder för intranasal kolonisering av möss med hjälp av en klinisk isolate stam av Streptococcus pneumoniae och efterföljande isolering och karakterisering av immunceller rekryteras till nasopharynx som svar på bakterierna. Vi visade hur ett bakteriellt inokulat kan odlas i näringsrika medier och användas för att etablera en koloniseringshändelse hos möss, som ursprungligen är begränsad till nasofarynx. Vi visade sedan hur svara immun cell typer som rekryte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr. Jeffery Weiser vid University of Pennsylvania för hans gåva av de kliniska stammarna av Streptococcus pneumoniae. Detta arbete finansierades av Canadian Institutes for Health Research. CV finansierades av ett M. G. DeGroote-stipendium och ett stipendium från Canadian Thoracic Society. Detta arbete finansierades av Ontario Lung Association och Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Arbetet i Bowdish-laboratoriet stöds delvis av michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research och McMaster Immunology Research Centre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number
Anti-Mouse Ly6C FITC BD Pharmingen 553104
Anti-Mouse Ly6G PE BD Pharmingen
Anti-Mouse CD45.1 eFluor 450 eBioscience 48-0453-82
Anti-Mouse F4/80 Antigen APC eBioscience 17-4801-82
Anti-Mouse CD11c PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 eBioscience 25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NC eBioscience 93-0041-42
Intramedic Polyethylene Tubing – PE20 Becton Dickinson 427406
BD 1ml Syringe Becton Dickinson 309659
BD 26G3/8 Intradermal Bevel Becton Dickinson 305110
Buffer RLT Lysis Buffer Qiagen 79216
Difco Tryptic Soy Agar Becton Dickinson 236950
Defibrinated Sheep Blood PML Microbiologicals A0404
RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931
M-MuLV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0253L
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).
  3. McCool, T. L., Cate, T. R., et al. The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage. J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).
  4. Nelson, A., Roche, A. M., et al. Capsule enhances pneumococcal colonisation by limiting mucus-mediated clearance. Infect. Immun. 75, 83-90 (2007).
  5. van Rossum, A., Lysenko, E., et al. Host and bacterial factors contributing to the clearance of colonisation by Streptococcus pneumoniae in a murine model. Infect. Immun. 73, 7718-7726 (2005).
  6. Barocchi, M. A., Ries, J., et al. A pneumococcal pilus influences virulence and host inflammatory responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2857-2862 (2006).
  7. Malley, R., Henneke, P., et al. Recognition of pneumolysin by Toll-like receptor 4 confers resistance to pneumococcal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1966-1971 (2003).
  8. McCool, T. L., Weiser, J. N. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect. Immun. 72, 5807-5813 (2004).
  9. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69 (1), 426-434 (2001).
  10. Jeong, D., Jeong, E., et al. Difference in resistance to Streptococcus pneumoniae infection in mice. Lab Anim. Res. 27, 91-98 (2011).
  11. Wu, H. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  12. Southam, D. S., Dolovich, M., et al. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position. Lung Physiol. 282, 833-839 (2002).
  13. Miller, M. A., Stabenow, J. M., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
  14. Briles, D. E., Novak, L. Nasal Colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73 (10), 6945-6951 (2005).
  15. Wu, H. -. Y., Virolainen, A., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  16. Mo, Y., Wan, R., et al. Application of reverse transcription-PCR and real-time PCR in nanotoxicity research. Methods Mol. Biol. 926, 99-112 (2012).
  17. Kuper, C. F., Koornstra, P. J., et al. The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Trends Immunol. 13, 219-224 (1992).
  18. Zhang, Q., Leong, S. C., et al. Characterisation of regulatory T cells in nasal associated lymphoid tissue in children: relationships with pneumococcal colonization. PLoS Pathog. 7, (2011).
  19. Briles, D. E., Novak, L., et al. Nasal colonization with Streptococcus pneumoniae includes subpopulations of surface and invasive pneumococci. Infect. Immun. 73, 6945-6951 (2005).
  20. Weinberger, D. M., Trzcinski, K., et al. Pneumococcal capsular polysaccharide structure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5, (2009).
  21. Bryant, W. P., J, , et al. Which Pneumococcal Serogroups Cause the Most Invasive Disease: Implications for Conjugate Vaccine Formulation and Use, Part I.. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  22. Hausdorff, W. P., Feikin, D. R., et al. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes. Lancet Infect. Dis. 5, 83-93 (2005).
  23. Brueggemann, A., Griffiths, D., et al. Clonal Relationships between Invasive and Carriage Streptococcus pneumoniae and Serotype and Clone Specific Differences in Invasive Disease Potential. J. Infect. Dis. 187, 1424-1432 (2003).
  24. Mohler, J., Azoulay-Dupis, E., et al. Streptococcus pneumoniae strain-dependent lung inflammatory responses in a murine model of pneumococcal pneumonia. Intensive Care Med. 29, 808-816 (2003).
  25. Wu, H. Y., Virolainen, A., Mathews, B., King, J., Russell, M. W., et al. Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice. Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).
  26. Zhang, Z., Clarke, T. B., et al. Cellular effectors mediating Th17-dependent clearance of pneumococcal colonization in mice. J. Clin. Invest. 119, 1899-1909 (2009).
  27. Parker, D., Martin, F. J., et al. Streptococcus pneumoniae DNA initiates type I interferon signaling in the respiratory tract. MBio. 2, (2011).
  28. Haya, D. L., Camilli, A. Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors. Mol. Microbiol. 45, 1389-1406 (2002).
  29. Nakamura, S., Favis, K. M., et al. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. J. Clin. Invest. 121, 3657-3665 (2011).
  30. Kim, J. O., Weiser, J. N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumoniae. J. Infect. Dis. 177, 368-377 (1998).
  31. Roche, A. M., King, S. J., et al. Live attenuated Streptococcus pneumoniae strains induce serotype-independent mucosal and systemic protection in mice. Infect. Immun. 75, 2469-2475 (2007).
  32. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  33. Cohen, J. M., Khandavalli, S., Camberlein, E., Hyams, C., Baxendale, H. E., Brown, J. S. Protective contributions against invasive Streptococcus pneumoniae pneumonia of antibody and Th17-Cell responses to nasopharyngeal colonisation. PLoS One. 6 (10), (2011).
  34. Richards, L., Ferreira, D. M., Miyaji, E. N., Andrew, P. W., Kadioglu, A. The immunising effect of pneumococcal nasopharyngeal colonisation; protection against future colonisation and fatal invasive disease. Immunobiology. , 215-251 (2010).
  35. Lanie, J. A., Ng, W. L., et al. Genome sequence of Avery’s virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
  36. Robertson, G. T., Ng, W. L., Foley, J., Gilmour, R., Winkler, M. E. Global transcriptional analysis of clpP mutations of type 2 Streptococcus pneumoniae and their effects on physiology and. 184, 3508-3520 (2002).
  37. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  38. Orihuela, C. J., Gao, G., et al. Organ-specific models of Streptococcus pneumoniae disease. Scand. J. Infect. D. 35, 647-652 (2003).
  39. Swirski, F. K., Nahrendorf, M., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).

Tags

Streptococcus PneumoniaeNasopharyngeal ColonizationIntranasalInflammatory ResponseImmune ResponseMouse ModelPneumoniaBacteremiaMeningitisResident MacrophagesLymphocytesBacterial Density
check_url/50490?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Puchta, A., Verschoor, C. P., Thurn, T., Bowdish, D. M. E. Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (83), e50490, doi:10.3791/50490 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image