Ischemie-reperfusie model van Acute Kidney Injury en Post Letsel Fibrosis in Muizen
Summary
We beschrijven modellen van matige en ernstige ischemie-reperfusie geïnduceerde nierschade waarin de muizen ondergaan unilaterale renale pedicle klemmen gevolgd door gelijktijdige of vertraagde contralaterale nefrectomie, respectievelijk. Deze modellen consequent aanleiding geven tot nierinsufficiëntie en na het letsel fibrose, maar letselernst en overleving afhankelijk zijn van de muis achtergrond, leeftijd en chirurgische apparatuur.
Abstract
Ischemie-reperfusie geïnduceerde acute nierschade (IR-AKI) wordt veel gebruikt als een model van de AKI in muizen, maar de resultaten zijn vaak erg variabel met een hoge, vaak niet-aangegeven sterftecijfers die analyses kunnen verwarren. Bilaterale renale pedicle klemming wordt vaak gebruikt om IR-AKI te induceren, maar de verschillen tussen de effectieve klem druk en / of renale reacties op ischemie tussen nieren vaak leiden tot meer variabele resultaten. Daarnaast worden kortere klem tijden gekend om meer variabele tubulaire beschadiging te induceren, en terwijl de muizen die een bilateraal letsel met meer klem keer coherenter tubulaire schade, ze sterven vaak binnen de eerste 3 dagen na het letsel als gevolg van ernstige nierinsufficiëntie. Om na het letsel overleving te verbeteren en het verkrijgen van meer consistente en voorspelbare resultaten, hebben we twee modellen van eenzijdige ischemie-reperfusie schade gevolgd door contralaterale nefrectomie ontwikkeld. Beide operaties worden uitgevoerd met een dorsale benadering, het verminderen van chirurgische stress als gevolg from ventrale laparotomie gebruikt voor muizen IR-AKI operaties. Voor inductie van matige schade BALB / c muizen vertonen eenzijdige klemming van de renale pedikel gedurende 26 min en ook gelijktijdig contralaterale nefrectomie ondergaan. Met deze aanpak, 50-60% van de muizen ontwikkelen matige AKI 24 uur na het letsel, maar 90-100% van de muizen overleven. Te bewegen ernstiger AKI, BALB / c muizen vertonen renale pedikel te klemmen 30 min gevolgd door contralaterale nefrectomie 8 dagen na verwonding. Dit maakt de functionele evaluatie van de nierfunctie herstel na een blessure met 90-100% overlevingskans. Vroege post-verwonding tubulaire schade alsmede post letsel fibrose zijn zeer consistent gebruik van dit model.
Introduction
Een verscheidenheid van experimentele modellen van acute nierschade (AKI) zijn ontwikkeld om de diversiteit en complexiteit van de menselijke conditie (zie verzoek om een recente, uitgebreide beoordeling 1) overeenkomen. Elk van deze modellen heeft zijn eigen sterke en zwakke punten, en terwijl elk bootst de bijbehorende menselijke omstandigheden met gevarieerde efficiëntie, niemand precies modelleren van de pathofysiologie van hun menselijke tegenhangers. Ischemie reperfusie (IR)-geïnduceerde AKI is ontwikkeld als een model van acute ischemie geïnduceerde nierbeschadiging op knaagdieren. Hoewel de ernst van renale tubulaire schade gezien in dit model wordt zelden waargenomen bij patiënten met nier hypoperfusie blessures 2, ondanks zijn beperkingen en vooral als gevolg van de relatief reproduceerbare karakter van dit model, heeft zijn uitgebreide gebruik verstrekt en, naar verwachting, zal blijven tot belangrijke inzichten in veel van de gemeenschappelijke basismechanismen van AKI, reparatie, en therapie 3. IR chirurgie fam vereistiliarity met de muis nieren anatomie die we hebben getoond in een vereenvoudigde vorm in figuur 1. Renale ischemie-reperfusie (IR) letsel operatie kan worden uitgevoerd via de ventrale (laparotomie) of dorsale (retroperitoneale) benaderingen. We maken gebruik van een dorsale benadering omdat het minder traumatisch, waardoor snellere hersteltijden en verbeterde overleving (met name bij de eerste leren van de procedure). Renale IR letsel kan unilateraal of bilateraal worden uitgevoerd. Verschillen tussen doeltreffende stop druk (die kunnen voortvloeien uit tussenkomst van perihilair vet tussen de klembekken) en / of verschillen in renale respons op ischemie tussen partijen tot meer variabele resultaten. Hoewel dit geen onoverkomelijk probleem, kan het verhogen van variabiliteit tussen experimenten, dat is een groot probleem voor dit model. Unilaterale IR kan worden uitgevoerd met contralaterale nefrectomie. Dit is onze voorkeursmethode aangezien het de variabiliteit tussen klemmen steeltjes en tegelijkertijd eenllows een om de nierfunctie, die niet wordt beïnvloed met alleen eenzijdige IR evalueren. Er is discussie over wat is de meest praktische vs optimale methode om de nierfunctie te evalueren in muizen. Bloedureumstikstof (BUN) biedt een maatstaf voor de nierfunctie en is een handige "first look" marker in sommige modellen van AKI, waaronder IR letsel. Echter, BUN niveaus worden beïnvloed door volumetoestand van de muizen die kunnen worden beïnvloed, in het bijzonder na ventrale benadering IR letsel bij vertraagd herstel vermindert orale opname van vloeistoffen voor een aantal dagen na de operatie. Serumcreatinine wordt minder beïnvloed door hydratatie status, maar is duidelijk beïnvloed door spiermassa. Een van de problemen met serumcreatinine metingen heeft problemen detectie van niet-creatinine chromogenen in muizenserum met pikrinezuur gebaseerde technieken. Als alternatief zijn een aantal centra een HPLC-gebaseerde methode voor muizen creatinine kwantificeren dat niet wordt beïnvloed door deze artefact 4 ontwikkeld. Echter, UNLike BUN en creatinine pikrinezuur assays vereisen vereisen slechts 5-10 gl serum, HPLC-assays vereisen ~ 25 pi serum per test, die indien uitgevoerd in duplicaat ~ 100 ul volbloed per assay vereist. Dit kan beperkend voor muizen studies. Sommige centra zijn gevoeliger HPLC en massaspectrometrie-gebaseerde methoden die analyse van kleinere steekproef volumes 5, 6 toestaan ontwikkeld. Echter, deze technologieën zijn niet overal beschikbaar. Een alternatieve, enzymatische cascade assay (die slechts 5-10 gl serum vereist) geëvalueerd in muizen en ratten serummonsters en getoond nauw parallel HPLC metingen van serumcreatinine tijdens pikrinezuur assays altijd overschatting creatininewaarden 7. Tijdens deze test wordt niet veel gebruikt in de literatuur AKI, de assay is commercieel verkrijgbaar, eenvoudig te gebruiken en we geeft betrouwbare resultaten met dit model van IR-geïnduceerde AKI in muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven twee modellen van IR-AKI de effecten van matige en ernstige nierschade bestuderen. Deze modellen kunnen wij consistente en voorspelbare letsel veroorzaken met lage sterfte. Ons protocol beschrijft veel van de moeilijkheden en valkuilen van oudsher geassocieerd met dit model. Bovendien hebben we aangetoond dat, afhankelijk van de lengte van renale pedikel klemming het model induceert een grotendeels reversibele milde en matige AKI, of ernstiger AKI met onvolledig herstel en aanhoudende renale fibrose. Na h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratorium Dr de Caestecker wordt ondersteund door NIH 1RO1 HL093057 01-1RC4DK090770-01. Dr Harris 'laboratorium wordt ondersteund door DK38226, DK51265, DK62794 en de financiering van de Veterans Administration. Ondersteuning voor muis nierschade operaties, serumcreatinine, en fibrose assays ook door de Vanderbilt O'Brien Kidney Injury Center subsidie 1P30 DK079341.
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
Riferimenti
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods Mol. Biol. 886, 363-379 (2012).
