Ischémie-reperfusion modèle de lésions rénales aiguës et post blessures fibrose chez la souris

Summary

Nous décrivons les modèles de lésions rénales ischémie-reperfusion induite modérée et sévère dans laquelle les souris subissent unilatérale pédicule rénal serrage suivie par néphrectomie controlatérale simultanée ou différée, respectivement. Ces modèles donnent systématiquement lieu à une insuffisance rénale et une fibrose post-traumatique, mais la gravité des blessures et la survie dépendent de fond, l'âge et chirurgical de la souris.

Abstract

Insuffisance rénale aiguë induite par l'ischémie-reperfusion (IR-AKI) est largement utilisé comme un modèle de AKI chez la souris, mais les résultats sont souvent très variable avec des taux élevés de mortalité souvent non déclarés qui peuvent fausser les analyses. Bilatérale pédicule rénal serrage est couramment utilisé pour induire IR-AKI, mais les différences entre les pressions de serrage efficaces et / ou des réponses à une ischémie rénale entre reins conduisent souvent à des résultats plus variables. En outre, les temps de serrage plus courtes sont connus pour induire des lésions aux tubules plus variable, et alors que les souris subissant une blessure bilatérale avec des temps de serrage plus développer lésion tubulaire plus cohérente, ils meurent souvent dans les 3 premiers jours après une blessure due à une insuffisance rénale sévère. Pour améliorer la survie post-traumatique et d'obtenir des résultats plus cohérents et prévisibles, nous avons développé deux modèles de lésions d'ischémie-reperfusion unilatérale suivie par néphrectomie controlatérale. Les deux chirurgies sont effectuées en utilisant une approche dorsale, la réduction du stress chirurgical résultant from laparotomie ventrale, couramment utilisé pour les souris IR-Aki chirurgies. Pour l'induction de blessures souris BALB / c modérés subissent unilatérale de serrage du pédicule rénal pour 26 min et subissent également une néphrectomie controlatérale simultanée. En utilisant cette approche, 50-60% des souris de développer modérée AKI 24 heures après la blessure, mais 90-100% des souris survivent. Pour induire une IRA plus grave, des souris BALB / c subissent pédicule rénal serrage pendant 30 min suivie par néphrectomie controlatérale 8 jours après la blessure. Cela permet une évaluation fonctionnelle de récupération rénale après une blessure à 90-100% de survie. Au début des lésions tubulaires post-traumatique ainsi que après une blessure fibrose sont hautement compatibles avec ce modèle.

Introduction

Une variété de modèles expérimentaux d'insuffisance rénale aiguë (IRA) ont été développés pour répondre à la diversité et à la complexité de la condition humaine (voir référence pour un récent examen exhaustif ^1). Chacun de ces modèles a ses propres forces et faiblesses, et tandis que chaque imite les conditions humaines correspondantes avec des rendements variés, aucun modéliser précisément la physiopathologie de leurs homologues humains. ischémie-reperfusion (IR) induite par AKI a été développé comme un modèle de lésion rénale induite par l'ischémie aiguë chez les rongeurs. Alors que la gravité de la blessure tubulaire rénale vu dans ce modèle est rarement observée chez les patients souffrant de lésions de hypoperfusion rénale ^2, malgré ses limites et en grande partie en raison de la nature relativement reproductible de ce modèle, son utilisation intensive a fourni, et il est prévu, continuera de fournir des indications importantes sur la plupart des mécanismes communs de base de AKI, la réparation et la thérapie ^3. Chirurgie IR nécessite familiarity avec l'anatomie du rein de souris, que nous avons illustré sous une forme simplifiée dans la figure 1. Chirurgie des lésions rénales ischémie-reperfusion (IR) peut être réalisée par des approches ventrales (laparotomie) ou dorsale (rétropéritonéale). Nous utilisons une approche dorsale car elle est moins traumatisante, permettant des temps de récupération plus rapide et une meilleure survie (en particulier lors de la première étude de la procédure). Rénale blessure IR peut être effectuée unilatéralement ou bilatéralement. Toutefois, les différences entre les pressions efficaces de serrage (qui peut résulter de l'interposition de la graisse péri-hilaire entre les mâchoires de la pince) et / ou des différences dans les réponses à une ischémie rénale entre les côtés conduit à des résultats plus variables. Si ce n'est pas un problème insurmontable, il peut augmenter la variabilité entre les expériences, ce qui est un enjeu majeur pour ce modèle. IR unilatérale peut être réalisée avec une néphrectomie controlatérale. C'est notre méthode de choix car elle réduit la variabilité de serrage entre pédicules, et en même temps uneP ermet un à évaluer la fonction rénale, qui n'est pas affecté par IR unilatérale seul. Il ya eu des discussions sur ce qui est la méthode la plus pratique vs optimale afin d'évaluer la fonction rénale chez les souris. Urée sanguine (BUN) fournit une mesure de la fonction rénale et est un "premier regard" marqueur utile dans certains modèles de AKI, y compris les blessures IR. Cependant, les niveaux BUN peuvent être affectés par l'état du volume des souris susceptibles d'être affectés, notamment à la suite ventral blessure IR d'approche, lorsque la récupération tardive réduit la prise orale de fluides pour un nombre de jours post-opératoires. La créatinine sérique est moins influencée par l'état d'hydratation mais il est clairement affectée par la masse musculaire. Une des difficultés avec des mesures de la créatinine sérique a eu des problèmes avec la détection des chromogènes non-créatinine dans le sérum de souris en utilisant des techniques à base d'acide picrique. Comme alternative, un certain nombre de centres ont mis au point une méthode HPLC à base de quantifier la créatinine de la souris qui n'est pas affectée par cet artefact ^4. Cependant, UNLike BUN et dosages de la créatinine de l'acide picrique, qui ne nécessitent 5-10 ul de sérum, HPLC tests nécessitent environ 25 pi par dosage sérique, qui si elle est effectuée en double, il faudra ~ 100 ul de sang total par dosage. Cela peut être un facteur limitant pour les études de souris. Certains centres ont développé des méthodes HPLC et spectrométrie de masse basée sur plus sensibles qui permettent une analyse de petits volumes d'échantillons ^{5, 6.} Cependant, ces technologies ne sont pas largement disponibles. Un essai en cascade alternative enzymatique (qui nécessite seulement 5-10 ul de sérum) a été évaluée dans des échantillons de sérum souris et le rat et montré ressemblerait de près mesures HPLC de la créatinine sérique alors que les tests de l'acide picrique toujours des valeurs de créatinine surestimer ^7. Bien que ce test n'est pas largement utilisé dans la littérature AKI, le dosage est disponible dans le commerce, simple à utiliser, et nous trouvons donne des résultats fiables avec ce modèle d'IR induite par AKI chez la souris.

Protocol

Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Notez que si l'on effectue plusieurs opérations sur différents souris, rincer les instruments après chaque utilisation, puis stériliser l'aide d'un stérilisateur à billes chaud. Il ne suffit pas de faire tremper dans de l'éthanol à 70%. Donner 0,5 ml S / C saline normale stérile préopératoire et postopératoire immédiate pour compenser la perte de liquide corporel pendant la chirurgie. Peser les souris. Anesthésier…

Representative Results

Modéré IR induite par AKI. IR unilatérale avec néphrectomie controlatérale simultanée réduit considérablement la variabilité des résultats, mais avec des temps de serrage courtes nécessaires pour les souris de survivre à cette procédure, nous avons trouvé encore que seulement 50-60% des souris ont développé l'insuffisance rénale attendu 24 heures après une blessure (figure 3A). En termes pratiques, cela crée des difficultés à évaluer les données, sauf si les ?…

Discussion

Nous décrivons deux modèles d'IR-AKI pour étudier les effets de l'atteinte rénale modérée et sévère. Ces modèles nous permettent d'induire des lésions cohérente et prévisible avec une faible mortalité. Notre protocole décrit bon nombre des difficultés et des écueils traditionnellement associés à ce modèle. Par ailleurs, nous avons montré que selon la longueur du pédicule rénal serrage, le modèle induit une légère ou modérée AKI largement réversibles, ou plus grave AKI avec récup?…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.