마우스의 급성 신장 손상 및 사후 상해 섬유증의 허혈 - 재관류 모델
Summary
우리는 쥐를 받아야하는 중간 및 심한 허혈 – 재관류 신장 손상의 모델을 설명 일방적 신 경 각각 동시 또는 지연 반대측 신장 절제 뒤에 체결. 이러한 모델은 지속적으로 신장 기능 장애 및 사후 부상 섬유증을 야기하지만, 부상 정도와 생존율 마우스 배경, 나이, 수술 장비에 따라 달라집니다.
Abstract
허혈 – 재관류 유도 급성 신장 손상 (IR-AKI)는 널리 생쥐 AKI의 모델로 사용하지만, 결과는 종종 분석을 혼동 수 있습니다 높은 종종보고되지 않은 사망률 매우 가변적입니다. 양측 신장 경 클램핑은 일반적으로 IR-AKI를 유도하는 데 사용하지만 효과적인 클램프 압력 및 / 또는 신장 사이의 허혈로 신장 반응의 차이는 종종 더 많은 변수를 결과로 이어질 있습니다. 또한, 짧은 클램프 시간이 더 많은 변수를 관 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 긴 클램프 시간으로 양국 간 손상을받은 쥐보다 일관된 관 부상을 개발하는 동안, 그들은 종종 심각한 신부전으로 인한 손상 후 첫 3 일 이내에 죽는다. 후 부상 생존을 개선하고보다 일관되고 예측 가능한 결과를 얻으려면, 우리는 반대측 신장 절제 뒤에 일방적 허혈 – 재관류 손상의 두 가지 모델을 개발했습니다. 두 수술은 F를 결과 수술 스트레스를 감소 등의 방법을 사용하여 수행됩니다일반적으로 마우스 IR-AKI 수술에 사용되는 ROM 복부 개복술. 신체 부상을 BALB / C 마우스의 유도를 위해 일방적는 26 분 동안 신장 작은 꽃자루의 클램핑 받아야하며 동시에 반대측 신장 절제를 겪는다. 이 방법을 사용하면, 마우스의 50 ~ 60 %는 부상 후 중간 AKI 24 시간을 개발하지만, 마우스의 90~100%이 남아있다. 더 심한 AKI를 유도하기 위해, BALB / C 마우스는 팔일 부상 후 반대측 신장 절제 뒤에 30 분 동안 클램핑 신 경을 받다. 이 90~100%의 생존 부상 후 신장 회복 기능 평가를 할 수 있습니다. 초기 이후 상해 관의 손상뿐만 아니라 포스트 부상 섬유증이 모델을 사용하여 매우 일치한다.
Introduction
급성 신장 손상 (AKI)의 실험 모델의 다양한 인간의 조건 (최근의 종합적인 검토 1 참조를 참조)의 다양성과 복잡성에 맞도록 개발되었습니다. 이 모델의 각각은 자신의 강점과 약점을 가지고 있으며, 각각 다양한 효율성에 해당하는 인간의 조건을 모방하면서, 아무도 정확하게 그들의 인간의 대응의 병태 생리를 모델링하지 않습니다. 허혈 재관류 (IR) 유도 AKI는 설치류의 급성 허혈에 의한 신 손상의 모델로 개발되었습니다. 이 모델에서 본 신 세뇨관 손상의 정도가 거의 한계에도 불구하고, 신장 저관류 손상 환자 2에서 관찰되며 주로하기 때문에이 모델의 상대적으로 재현 특성으로 인해 광범위한 사용을 제공하고, 그것은이 예상되는 반면, 계속 공통 기본 AKI의 메커니즘, 수리, 및 치료 3의 많은에 중요한 통찰력을 제공합니다. IR 수술은 FAM이 필요합니다우리는 그림 1의 단순화 된 형태로 예시 한 마우스 신장 해부학과 iliarity. 신장 허혈 – 재관류 (IR) 상해 수술은 복부 (개복술) 또는 지느러미 (복막) 방식을 통해 수행 할 수 있습니다. 덜 충격 때문에 우리는 더 빠른 복구 시간과 향상된 생존 (첫 번째 절차를 학습 특히) 허용 등의 방법을 사용합니다. 신장 IR 부상은 일방적 또는 양자 수행 할 수 있습니다. 그러나 효과적인 클램프 압력 (클램프 턱 사이 perihilar 지방 개재에서 발생할 수있는) 및 / 또는면 사이 허혈로 신장 반응의 차이 사이의 차이가 더 많은 변수가 결과에 이르게한다. 이 극복 할 수없는 문제가되지 않지만,이 모델에 대한 큰 문제입니다, 실험 사이의 변동성을 증가시킬 수 있습니다. 일방적 인 IR은 콘트라 측면 절제를 수행 할 수 있습니다. 이것은이 pedicles 사이에 체결의 변화를 감소 이후 동시에 선택의 우리의 방법입니다llows 하나 혼자 일방적으로 IR에 영향을받지 않고 신장 기능을 평가합니다. 생쥐의 신장 기능을 평가하는 가장 실용적인 대 최적의 방법입니다 것에 대해 논의가 있었다. 혈액 요소 질소 (BUN)는 신장 기능의 측정을 제공하고 IR 부상 등 AKI의 일부 모델에 유용 "첫번째보기"마커입니다. 회복 지연이 일 후 수술의 수에 대한 유체의 경구 섭취를 줄일 경우 단, BUN 수준은, 특히 복부 접근 IR 부상에 따라 영향을받을 수 있습니다 생쥐의 볼륨 상태에 의해 영향을받을 수 있습니다. 혈청 크레아티닌이 적은 수분 상태에 의해 영향을하지만 명확하게 근육 질량에 의해 영향을받습니다. 혈청 크레아티닌 측정에 어려움 중 하나는 피크르산 기반 기술을 사용하여 마우스 혈청의 비 크레아티닌 chromogens의 검출에 문제가있다. 대안으로, 센터의 수는이 이슈 4에 의해 영향을받지 않습니다 마우스 크레아티닌을 정량화 HPLC 기반 방법을 개발했습니다. 그러나 UNLIKE BUN 및 혈청 만 5-10 μl를 필요로 picric 산 크레아티닌 분석은 HPLC-분석은 ~ 25 μL 분석 기준 혈청, 중복 수행하면 분석 당 전혈 ~ 100 μl를 요구합니다.이 필요합니다 이 기능은 마우스 공부를 제한 할 수 있습니다. 일부 센터는 작은 샘플 볼륨 5, 6, 분석 할 수 있도록 더 민감 HPLC 및 질량 분석 기반 방법을 개발했습니다. 그러나 이러한 기술은 널리 사용할 수 없습니다. 대안, 효소 연쇄 분석은 (혈청 5-10 μl를 요구하는) 마우스 및 쥐의 혈청에서 평가 밀접 혈청 크레아티닌 피크르산의 분석은 항상 과대 평가 크레아티닌 값 동안 7 HPLC 측정을 병행하기 위해 표시되었습니다. 이 분석은 널리 AKI 문헌에서 사용하지 않는 동안, 분석은 사용하기 간단 상업적으로 사용할 수 있습니다, 우리는 생쥐의 IR 유도 AKI의 모델과 신뢰할 수있는 결과를 제공 찾을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 중등도 및 중증 신 손상의 효과를 연구하기 위해 IR-AKI의 두 가지 모델에 대해 설명합니다. 이 모델은 우리가 낮은 사망률과 일관성 있고 예측할 수있는 부상을 유발 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 전통적으로이 모델과 관련된 어려움과 함정의 많은 설명합니다. 더욱이, 우리는 신 경 클램핑 길이에 따라 모델이 불완전 복구 및 지속적인 신장 섬유증 크게 가역 온화하고 온건 한 AKI, 또…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
닥터 드 CAESTECKER의 연구실은 NIH 1RO1 HL093057 – 01 1RC4DK090770-01에 의해 지원됩니다. 해리스 박사 '실험실 DK38226, DK51265, DK62794 및 재향 군인의 관리의 자금에 의해 지원됩니다. 또한 밴더빌트 오브라이언 신장 손상 센터 보조금 1P30 DK079341에서 제공하는 마우스 신장 손상 수술, 혈청 크레아티닌 및 섬유증 분석을 지원합니다.
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
Riferimenti
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