Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Summary

Descrevemos modelos de lesão renal por isquemia e reperfusão induzida moderada e grave em que os ratos submetidos a clampeamento do pedículo renal unilateral seguido de nefrectomia contralateral simultânea ou tardia, respectivamente. Estes modelos consistentemente dar origem a uma disfunção renal e fibrose pós-lesão, mas a gravidade da lesão e sobrevivência dependem de fundo, idade e equipamento cirúrgico mouse.

Abstract

Isquemia-reperfusão induzida lesão renal aguda (IR-AKI) é amplamente utilizado como um modelo de LRA em camundongos, mas os resultados são muitas vezes bastante variável, com altas taxas de mortalidade muitas vezes não declarada que pode confundir análises. Bilateral pedículo clampeamento renal é comumente usado para induzir o IR-AKI, mas as diferenças entre as pressões de fixação eficazes e / ou respostas renais à isquemia entre os rins muitas vezes levam a resultados mais variáveis. Além disso, os tempos mais curtos da braçadeira são conhecidas por induzir a lesão tubular mais variável, e quando os ratos submetidos a lesão bilateral com tempos mais longos da braçadeira desenvolver lesão tubular mais consistente, eles morrem frequentemente durante os primeiros 3 dias após a lesão devido a insuficiência renal grave. Para melhorar a sobrevivência pós-lesão e obter resultados mais consistentes e previsíveis, desenvolvemos dois modelos de lesão unilateral de isquemia-reperfusão, seguido por nefrectomia contralateral. Ambas as cirurgias são realizadas através de uma abordagem dorsal, reduzindo o stress cirúrgico resultando from laparotomia ventral, comumente usado para rato IR-AKI cirurgias. Para a indução da lesão ratinhos BALB / c moderadas submeter unilateral de aperto do pedículo renal durante 26 min, e também submetidos a nefrectomia contralateral simultâneo. Utilizando esta abordagem, 50-60% dos ratinhos desenvolvem moderada LRA 24 h depois da lesão, mas 90-100% dos ratinhos sobreviver. Para induzir o LRA mais grave, ratinhos BALB / c sofrem pedículo renal aperto durante 30 min seguido por nefrectomia contralateral 8 dias após o ferimento. Isto permite a avaliação funcional da recuperação renal após lesão com 90-100% de sobrevivência. Cedo dano tubular pós-lesão, bem como a fibrose pós lesão são altamente consistente com esse modelo.

Introduction

A variedade de modelos experimentais de lesão renal aguda (LRA) foram desenvolvidos para atender a diversidade e complexidade da condição humana (ver referência para a recente revisão abrangente ^1). Cada um desses modelos tem as suas próprias forças e fraquezas, e enquanto cada imita as condições humanas correspondentes com eficiências variadas, nenhum modelar com precisão a fisiopatologia de seus colegas humanos. Isquemia-reperfusão (IR) induzida LRA tem sido desenvolvido como um modelo de lesão renal induzida por isquemia aguda em roedores. Embora a gravidade da lesão tubular renal visto neste modelo é raramente observada em pacientes com lesões hipoperfusão renal ^2, apesar de suas limitações e, em grande parte devido à natureza relativamente reprodutível deste modelo, sua ampla utilização tem proporcionado e, espera-se, continuará fornecer importantes insights sobre muitos dos mecanismos básicos comuns da AKI, reparo e terapia ^3. Cirurgia IR requer familiarity com a anatomia do rim do rato, que tenham ilustrado de forma simplificada na figura 1. Lesão de isquemia-reperfusão (IR) cirurgia lesão renal pode ser realizada por meio de ventrais (laparotomia) ou dorsal abordagens (retroperitoneal). Nós usamos uma abordagem dorsal, pois é menos traumática, permitindo que o tempo de recuperação mais rápido e melhor sobrevivência (particularmente quando se aprende primeiro o procedimento). Lesão renal IR pode ser feita unilateralmente ou bilateralmente. No entanto, as diferenças entre as pressões eficazes braçadeira (que podem resultar da interposição de gordura perihilário entre as mandíbulas de aperto) e / ou diferenças nas respostas renais, a isquemia, entre os lados conduz a resultados mais variáveis. Enquanto isso não é um problema insuperável, ele pode aumentar a variabilidade entre os experimentos, que é um grande problema para este modelo. IR unilateral pode ser realizada com a nefrectomia contralateral. Este é o nosso método de escolha, uma vez que reduz a variabilidade no aperto entre pedículos e, ao mesmo tempo, umallows uma para avaliar a função renal, o que não é afectado com IR unilateral sozinho. Houve discussão sobre o que é o método mais prático vs ideal para avaliar a função renal em camundongos. Uréia (BUN) fornece uma medida da função renal e é um "primeiro olhar" marcador útil em alguns modelos de AKI, incluindo lesão IR. No entanto, os níveis de uréia pode ser afetada pelo estado do volume dos ratos que podem ser afetados, especialmente após abordagem ventral lesão IR, quando a recuperação tardia reduz a ingestão oral de fluidos para um número de dias pós-cirurgia. A creatinina sérica é menos influenciada pelo estado de hidratação, mas está claramente afetada pela massa muscular. Uma das dificuldades com medidas de creatinina sérica tem havido problemas com a detecção de cromógenos não de creatinina no soro de rato usando técnicas à base de ácido pícrico. Como uma alternativa, um número de centros de ter desenvolvido um método baseado em HPLC para quantificar a creatinina do rato, que não é afectado por este artefato ^4. No entanto, unlike BUN e pícrico ensaios de creatinina de ácido, que requerem apenas 5-10 ul de soro, HPLC ensaios requerem ~ 25 soro uL por ensaio, a qual se for realizada em duplicado exigirá ~ 100 uL de sangue total por ensaio. Isto pode ser limitante para estudos do rato. Alguns centros têm desenvolvido métodos HPLC e Massa baseada em espectrometria mais sensíveis que permitem a análise de volumes de amostra menores, ^{5, 6.} No entanto, estas tecnologias não são facilmente acessíveis. Um, o ensaio de cascata enzimática alternativa (que requer apenas 5-10 ul de soro) foi avaliada em ratos e amostras de soro de rato e mostrado para paralelo de perto as medições de HPLC de creatinina sérica, enquanto os testes de ácido pícrico sempre valores de creatinina sobrestimar ^7. Embora este ensaio não é amplamente utilizada na literatura LRA, o ensaio é comercialmente disponível, simples de utilizar, e descobrimos dá resultados fiáveis ​​com este modelo de IR induzida LRA em ratinhos.

Protocol

Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Note-se que se está realizando várias cirurgias em diferentes camundongos, lavar instrumentos após o uso e, em seguida, esterilizar utilizando um esterilizador talão quente. Não é suficiente para absorver, em etanol a 70%. Dar origem a 0,5 ml de S / C de soro fisiológico estéril pré-operatório e pós-operatório imediato para compensar a perda de fluido do corpo durante a cirurgia. Pesar os ratinhos. Anestesiar mouse usando Xilazina I…

Representative Results

Moderado IR induzida AKI. IR Unilateral com nefrectomia contralateral simultânea reduz substancialmente a variabilidade nos resultados, mas com tempos mais curtos de fixação necessários para os ratos para sobreviver a este procedimento, ainda constatou que apenas 50-60% dos camundongos desenvolveu o esperado insuficiência renal 24 hr após a lesão (Figura 3A). Em termos práticos, isso cria dificuldades avaliação dos dados, a menos que os estudos envolvem esquemas de tratamento …

Discussion

Nós descrevemos dois modelos de IR-AKI para estudar os efeitos da lesão renal moderada e grave. Estes modelos permitem induzir lesão consistente e previsível, com baixa mortalidade. Nosso protocolo descreve muitas das dificuldades e armadilhas tradicionalmente associados com este modelo. Além disso, mostrámos que, dependendo do comprimento do pedículo clampeamento renal, o modelo induz uma ligeira e moderada LRA reversível em grande parte, ou LRA mais grave, com uma recuperação incompleta e fibrose renal persi…

Materials

Drug or solution	Company	Catalogue number	Comments
Ketamine (anesthetic)	Webster Veterinary	07-881-9413 (100 mg/ml)	Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine)
Xylazine (analgesic)	Webster Veterinary	07-808-1939 (100 mg/ml)	As above
Antisedan (anti-Xylazine)	Webster Veterinary	07-867-7097 (5 mg/ml)	Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg
Buprenorphine (analgesic)	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml)	Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution.
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Betadine swab sticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-01
Nolvasan Surgical Scrub	Pfizer Animal Care	300253
			Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery.
Iris Scissors	Integra Miltex	VWR 21909-404	For skin and muscle dissection
Curved iris forceps	FST	11065-07	To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat
Blunt forceps	ROBOZ	RS-5228	To manipulate kidneys
Vascular clamp (795 g pressure)	ROBOZ	RS-5459	Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains
Schwartz clip applying forceps	ROBOZ	RS-5450	For RS-5459 clamps
Vascular clamp (75-85 g pressure)	FST	18055-02	Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock	FST	18056-14	For FST 18055-02 clamps
Gayman T/Pump (water-bath heated platform)	Braintree Scientific	TP-650	The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery
15″ W x 24″ Heated platform	Braintree Scientific	HHP-2	Connect to Gayman heated water pump
Heating pad	Braintree Scientific	Model 39DP	Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery
Absorbable suture (Vicryl 5-0)	ETHICON	VCP834G	For fascia and muscle
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B)	CP Medical	CP-B660B-03	For skin
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm	FST	12501-13	To hold suture needles
Timer	FST	06-662-3	To quantify ischemia time
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol)
Electric razor	Braintree Scientific	CLP-22965
Tape	Durapore	1538-0
1 ml Syringe	EXELint	26044
Sterile cotton tipped applicators	Kendall	8884541300
Absorbent BenchPad	VWR	56617-014
Surgical drapes	VWR	21902-985	Need to be autoclaved
2” x 2” Gauze Pads	Medi-First	60673
Sterile gloves	Cardinal Health	2D7251
			Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery.