Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model
Summary
Biz fareler tabi olan orta ve ağır iskemi-reperfüzyon bağlı böbrek hasarı modelleri tanımlamak tek taraflı renal pedikül sırasıyla, eş zamanlı veya gecikmeli taraf nefrektomi takip sıkma. Bu modeller sürekli böbrek fonksiyon bozukluğu ve post-yaralanma fibrozis yol, ancak yaralanma şiddeti ve yaşam fare arka plan, yaş ve cerrahi ekipman bağlıdır.
Abstract
Iskemi-reperfüzyon oluşturulan akut böbrek hasarı (IR-AKI) yaygın olarak farelerde AKI bir model olarak kullanılan, ancak sonuçlar genellikle analiz yanıltabilecek yüksek, sık sık rapor edilmemiş ölüm oranları ile oldukça değişkendir edilir. Bilateral renal pedikül sıkma yaygın IR-AKI ikna etmek için kullanılır, ama etkili kelepçe basınçları ve / veya böbrek arasında iskemi böbrek yanıtları arasındaki farklılıkları daha sık değişken sonuçlara yol olduğunu. Buna ek olarak, daha kısa kelepçe kat daha fazla değişken boru hasara yol bilinmektedir, ve daha uzun kelepçe kez ikili yaralanma geçiren fareler daha tutarlı boru hasarına yol ise, genellikle şiddetli böbrek yetmezliği nedeniyle yaralanma sonrası ilk 3 gün içinde ölür. Sonrası yaralanma hayatta kalma geliştirmek ve daha tutarlı ve öngörülebilir sonuçlar elde etmek için, biz taraf nefrektomi ardından tek taraflı iskemi-reperfüzyon hasarının iki model geliştirdik. Her iki ameliyat f sonuçlanan cerrahi stresi azaltarak, bir dorsal yaklaşım kullanılarak yapılmaktadıryaygın olarak fare IR-AKI ameliyatlar için kullanılan rom ventral laparotomi,. Orta derecede yaralanmaya BALB / c farelerde indüksiyonu için tek taraflı 26 dakika boyunca renal pedikül sıkma geçmesi ve aynı zamanda eş zamanlı kontralateral nefrektomi. Bu yaklaşımı kullanarak, farelerin% 50-60 yaralanma sonrası orta AKI 24 saat geliştirmek ama farelerin% 90-100 hayatta. Daha şiddetli AKI ikna etmek için, BALB / c farelerde 8 gün yaralanma sonrası kontralateral nefrektomi ardından 30 dakika için terminal böbrek pedikül tabi. Bu 90-100% hayatta kalma ile yaralanma sonrası böbrek iyileşme fonksiyonel değerlendirme sağlar. Erken sonrası yaralanma tübüler hasar yanı sıra sonrası yaralanma fibrozis bu modeli kullanarak son derece tutarlıdır.
Introduction
Akut böbrek hasarı (ABH) deneysel modellerinde çeşitli insan durumu (yeni, kapsamlı bir yorum 1 için referans bakınız) çeşitliliği ve karmaşıklığı maç için geliştirilmiştir. Bu modellerin her biri kendi güçlü ve zayıf yönleri vardır, ve her çeşitli verimliliği ile ilgili insan koşulları taklit ederken, hiçbiri tam olarak insan meslektaşları patofizyolojisi modeli. Iskemi reperfüzyon (IR)-kaynaklı AKI kemirgenlerde akut iskemi kaynaklı böbrek hasarının bir model olarak geliştirilmiştir. Bu modelde görülen renal tübüler hasar şiddeti nadiren sınırlamalara rağmen, renal hipoperfüzyon yaralanmaları olan hastalarda 2 görülmektedir ve büyük ölçüde çünkü bu model nispeten tekrarlanabilir doğa, geniş kullanım sağlamıştır ve bu beklenirken, devam edecek ortak temel AKI mekanizmaları, onarım, ve tedavi 3 birçok içine önemli bilgiler sağlamak için. IR cerrahi fam gerektirir, Şekil 1 'de, basitleştirilmiş bir formda gösterilen adres fare böbrek anatomisi ile iliarity. Böbrek iskemi-reperfüzyon (IR) hasarı cerrahi ventral (laparatomi) veya dorsal (retroperitoneal) yaklaşımları ile yapılabilir. Daha az travmatik olduğundan daha hızlı iyileşme süreleri ve sağkalım (ilk işlem öğrenme özellikle) sağlayan, bir dorsal yaklaşım kullanın. Böbrek IR yaralanma tek taraflı veya iki taraflı yapılabilir. Bununla birlikte, etkili bir kelepçe basınçları (kelepçe çene arasına perihiler yağ araya girmesi sonucu olabilir) ve / veya yanlar arasında renal iskemi yanıtları arasında önemli farklılıklar daha değişken sonuçlara yol açar. Bu aşılamaz bir sorun olmasa da, bu model için önemli bir konu olan, deneyler arasında değişkenlik artırabilir. Tek taraflı IR kontra-yan nefrektomi ile yapılabilir. Bu da pediküller arasında sıkma değişkenlik azalttığı ve aynı zamanda seçim bizim yöntemdirllows tek başına tek taraflı IR ile etkilenmez böbrek fonksiyon, değerlendirmek. Farelerde böbrek fonksiyonu değerlendirmek için en pratik vs uygun yöntem ne olduğu hakkında tartışmalar vardır. Kan üre azotu (BUN) böbrek fonksiyon bir ölçü sağlar ve IR yaralanma da dahil olmak üzere AKI bazı modellerde, yararlı bir "ilk bakış" belirtecidir. Gecikmiş kurtarma gün sonrası cerrahi bir dizi için sıvı içirin azaltır Ancak, BUN seviyeleri, özellikle ventral yaklaşım IR yaralanma sonrası, etkilenebilir farelerin birim durumu etkilenebilir. Serum kreatinin az hidrasyon durumu etkilenir ama açıkça kas kütlesi etkilenir. Serum kreatinin ölçümleri ile ilgili zorluklardan biri pikrik asit bazlı teknikler kullanılarak fare serumu olmayan kromojenler kreatinin tespiti ile ilgili sorunlar olmuştur. Alternatif olarak, merkezleri bir dizi bu eser 4 etkilenmez fare kreatinin ölçmek için bir HPLC-tabanlı bir yöntem geliştirdik. Bununla birlikte, UNLike BUN ve sadece serum 5-10 ul gerektirir pikrik asit, kreatinin deneyleri, HPLC tahlilleri ~ 25 ul analiz başına, serum, iki kopya halinde gerçekleştirilir halinde analiz başına tam kan ~ 100 ul gerektirir. gerektirir Bu fare çalışmalar için sınırlayıcı olabilir. Bazı merkezlerde küçük örnek hacmi 5, 6 analizi izin daha duyarlı HPLC ve kütle spektrometresi tabanlı yöntemler geliştirdik. Ancak, bu teknolojilerin yaygın olarak mevcut değildir. Bir alternatif, enzimatik kaskad tahlili (serum sadece 5-10 ul gerektirir), fare ve sıçan serum numuneleri ile değerlendirilir ve yakından serum kreatinin pikrik asit testleri her zaman aşırı tahmin kreatinin değeri ise 7 HPLC ölçümleri paralel olduğu gösterilmiştir. Bu tahlilde yaygın AKI literatürde kullanılan olmasa da, tahlil, kullanımı basit, ticari olarak mevcuttur, ve farelerde IR indüklenen AKI Bu modelle güvenilir sonuçlar veren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz orta ve şiddetli renal hasar etkilerini incelemek için IR-AKI iki model açıklar. Bu modeller bize düşük mortalite ile tutarlı ve öngörülebilir hasara yol sağlar. Bizim protokol geleneksel olarak bu model ile ilgili zorluklar ve tuzaklar birçok özetliyor. Ayrıca, renal pedikül sıkma uzunluğuna bağlı olarak, model eksik kurtarma ve kalıcı böbrek fibrozis ile büyük ölçüde geri dönüşümlü hafif ve orta derecede AKI, ya da daha şiddetli AKI neden olduğunu göstermiştir. Ciddi IR-AKI mod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr de CAESTECKER laboratuvar NIH 1RO1 HL093057-01 ve 1RC4DK090770-01 tarafından desteklenmektedir. Dr Harris'in laboratuvar DK38226, DK51265, DK62794 ve Gaziler İdaresi fon tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Vanderbilt O'Brien Böbrek Sakatlık Merkezi hibe 1P30 DK079341 tarafından sağlanan fare böbrek hasarı cerrahi, serum kreatinin ve fibrozis testleri için destek.
Materials
| Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
| Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
| Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
| Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
| Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
| Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
| Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
| Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
| Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
| Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
| Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
| Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
| Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
| Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
| Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
| Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
| 15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
| Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
| Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
| Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
| Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
| Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
| Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
| Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
| Tape | Durapore | 1538-0 | |
| 1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
| Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
| 2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
| Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
| Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |
Riferimenti
- Singh, A. P., Junemann, A., Muthuraman, A., Jaggi, A. S., Singh, N., Grover, K., Dhawan, R. Animal models of acute renal failure. Pharmacological reports: PR. 64, 31-44 (2012).
- Heyman, S. N., Rosenberger, C., Rosen, S. Experimental ischemia-reperfusion: Biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited. Kidney Int. 77, 9-16 (2010).
- Lieberthal, W., Nigam, S. K. Acute renal failure. II. Experimental models of acute renal failure: Imperfect but indispensable. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F1-F12 (2000).
- Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, 1959-1967 (2004).
- Yuen, P. S., Dunn, S. R., Miyaji, T., Yasuda, H., Sharma, K., Star, R. A. A simplified method for HPLC determination of creatinine in mouse serum. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, F1116-F1119 (2004).
- Hetu, P. O., Gingras, M. E., Vinet, B. Development and validation of a rapid liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry (LC-IDMS/MS) method for serum creatinine. Clin. Biochem. 43, 1158-1162 (2010).
- Keppler, A., Gretz, N., Schmidt, R., Kloetzer, H. M., Groene, H. J., Lelongt, B., Meyer, M., Sadick, M., Pill, J. Plasma creatinine determination in mice and rats: An enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in G2/M mediates kidney fibrosis after injury. Nat. Med. 16, 535-543 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122, 462-468 (1986).
- Chawla, L. S., Amdur, R. L., Amodeo, S., Kimmel, P. L., Palant, C. E. The severity of acute kidney injury predicts progression to chronic kidney disease. Kidney Int. 79, 1361-1369 (2012).
- Lo, L. J., Go, A. S., Chertow, G. M., McCulloch, C. E., Fan, D., Ordonez, J. D., Hsu, C. Y. Dialysis-requiring acute renal failure increases the risk of progressive chronic kidney disease. Kidney Int. 76, 893-899 (2009).
- Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69, 1023-1025 (2000).
- Muller, V., Losonczy, G., Heemann, U., Vannay, A., Fekete, A., Reusz, G., Tulassay, T., Szabo, A. J. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: Possible role of endothelin. Kidney Int. 62, 1364-1371 (2002).
- Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, 2375-2383 (2008).
- Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods Mol. Biol. 886, 363-379 (2012).
