Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Summary

Dette papir viser en protokol til at karakterisere de mekaniske egenskaber af levende celler ved hjælp af microindentation hjælp af en Atomic Force Microscope (AFM).

Abstract

Mekaniske egenskaber af celler og ekstracellulær matrix (ECM) spiller en vigtig rolle i mange biologiske processer, herunder stamceller differentiering, tumordannelse og sårheling. Ændringer i stivhed af celler og ECM er ofte tegn på ændringer i celle fysiologi eller sygdomme i væv. Derfor celle stivhed er et indeks for at vurdere forløbet af cellekulturer. Blandt de mange metoder, der anvendes til at måle stivheden af ​​celler og væv, giver mikro-indrykning ved hjælp af en Atomic Force Microscope (AFM) en måde at pålideligt måle stivheden af ​​levende celler. Denne metode har været almindeligt anvendt til at karakterisere mikroskala stivhed for en række forskellige materialer lige fra metaloverflader til blødt biologisk væv og celler. Det grundlæggende princip i denne metode er at indrykke en celle med en AFM spids valgte geometri og måle den påførte kraft fra bøjning af AFM cantilever. Montering af kraft-indrykning kurve til Hertz tilstandl for den tilsvarende spids geometri kan give kvantitative målinger af materiale stivhed. Dette papir viser proceduren for at karakterisere stivhed levende celler ved hjælp AFM. Vigtige trin, herunder processen med AFM kalibrering, force-kurve erhvervelse og dataanalyse ved hjælp af en Matlab rutine er påvist. Begrænsninger af denne metode er også drøftet.

Introduction

Mekaniske egenskaber, især stivhed, af individuelle celler og deres omgivende ekstracellulære matricer (ECM) er kritisk for mange biologiske processer, herunder cellevækst, motilitet, division, differentiering og vævshomeostase. ^1. Det er blevet påvist, at celle mekanisk stivhed hovedsageligt bestemmes af cytoskelettet, især netværk af actin og intermediære filamenter og andre proteiner forbundet med dem. ² Resultater fra mekaniske tests på in vitro netværk af actin og intermediære filamenter tyder på, at den celle mekanik er i høj grad afhængig af cytoskeletal struktur og pre-stress i cytoskelettet. ^3-5 Stivhed af levende celler er derefter betragtes som et indeks til at evaluere cytoskeletal struktur ^6, myosin aktivitet ⁷ og mange andre cellulære processer. Endnu vigtigere er ændringer i celle mekaniske egenskaber også ofte anset for at være tæt associeretbundet med forskellige sygdomstilstande såsom tumor dannelse og metastase ^8-10 Overvågning den mekaniske stivhed levende celler kan derfor tilvejebringe en ny måde at overvåge celle fysiologi,. at opdage og diagnosticere sygdomme ^8,. og vurdere effektiviteten af medicinsk behandling ^{11 , 12}

Flere metoder, herunder partikel-sporing microrheology, ^13-16 magnetisk vridning cytometri, ¹⁷ mikropipette aspiration ^18,19 og microindentation ^20-22 er blevet udviklet til at måle elasticiteten af cellerne. Partikel sporing microrheology sporer termiske vibrationer enten submikrone fluorescerende partikler injiceret ind i celler eller referencemærker markører inde i cellen cytoskeleton. ^23. Elastiske og tyktflydende egenskaber af celler beregnes ud fra de målte partikel forskydninger ved hjælp af udsving-dissipation teorem. ^14,23 Denne metode giver samtidige målinger af lokalmekaniske egenskaber med høj rumlig opløsning på forskellige steder i en celle. Dog kan injicere fluorescerende partikler i celler føre til ændringer i cellefunktion, cytoskeleton struktur og dermed Cellemekanik. Mikropipette aspiration metode gælder undertryk i en mikropipette med en diameter fra 1 til 5 m til at suge et lille stykke af cellemembranen ind i pipetten. Celle stivhed beregnes ud fra den anvendte undertryk og cellemembran deformation. ^18. Denne fremgangsmåde kan imidlertid ikke detektere heterogen fordeling af stivhed over cellen. Magnetisk vride cytometri (MTC) gælder magnetfelt til at generere drejningsmoment på super paramagnetiske kugler knyttet til cellemembranen. ^17. Cell stivhed er afledt i denne fremgangsmåde fra forholdet mellem den påførte drejningsmoment og vride deformation af cellemembranen. Det er vanskeligt at styre placeringen af ​​magnetiske perler i MTC metoden, og det er også challenging at karakterisere vride deformation med høj opløsning. Microindentation anvender en indrykning med veldefineret geometri at punch ind i cellen. Den indrykke kraft, og den resulterende indrykning i celler ofte følger forudsigelsen af ​​Hertz model. Youngs moduli af celler kan beregnes ud fra kraft-indrykning kurver ved at montere dem til Hertz model. Denne metode har været almindeligt anvendt til at teste de mekaniske egenskaber af væv og celler på trods af dens begrænsninger såsom usikkerhed i kontakt bestemmelse, anvendeligheden af ​​Hertz-modellen, og potentialet fysisk skade cellerne. Blandt de mange enheder til microindentaion ²⁰ er Atomic Force Microscope (AFM) kommercielt tilgængelige og har været almindeligt anvendt til at karakterisere mekaniske egenskaber af levende celler og væv ^21,24-27.

Dette papir viser proceduren for anvendelse af en asyl MFP3D-Bio AFM til at karakterisere celle mekanik. AFM ikke påly giver høj opløsning topografi af celler, men også har været almindeligt anvendt til at karakterisere de mekaniske egenskaber af vævsceller. Princippet om AFM indrykning er illustreret i figur 1.. AFM cantilever nærmer cellen fra nogle få mikrometer ovenfor; kommer i kontakt med cellen, led cellen, således at cantilever nedbøjningen når et forvalgt setpunkt, og trækker sig væk fra cellen. Under denne proces cantilever afbøjningen registreres som en funktion af dens placering som vist i figur 1.. Før du foretager kontakt med cellen, bevæger cantilever i mediet uden nogen tilsyneladende afbøjning. Når indrykning på cellen, cantilever bøjninger og afbøjning signal stiger. Køreledningsophæng er modelleret som elastiske bjælker, så deres afbøjning er proportional med den kraft, der påføres cellen. Ved at indstille den maksimale cantilever afbøjning, er den maksimale størrelse af kraft, der påføres prøven begrænset for at undgå dAmage til celler. Den del af den kraft, kurve fra punkt b til punkt C i figur 1, hvor spidsen led ind i cellen, er egnet til den hertz model til at udtrække cellen stivhed.

Figur 1. Illustration af AFM microindentation og fortolkning af kraftkurve. Det øverste panel viser bevægelsen af AFM cantilever drevet af piezo scanneren. Den lodrette placering af fritbærende z og cantilever afbøjning signalet d registreres under processen. Cantilever starter fra punkt a, nogle få mikrometer over cellen. Mens nærmer cellen, prøven indrykning δ forbliver nul, indtil den når punkt B, hvor spidsen kommer i kontakt med cellen. Koordinaterne for punkt B i plottet er kritiske værdiertil dataanalyse, der betegnes med (z _0, d _0>). Fra B til C, indtil cantilever led ind i cellen cantilever nedbøjningen når et sæt punkt, som er indstillet til at være forholdet mellem den tilsigtede maksimale indrykning kraft og cantilever fjederkonstant. Når udbøjningen signalet når den indstillede maksimale værdi, cantilever trækkes derefter tilbage fra cellen til punkt D, hvor det ofte trækkes nedad på grund af spids-prøve vedhæftning, frigøres fra cellen og vender tilbage til sin oprindelige placering på e. Højre panel illustrerer forholdet mellem fordybningen og den optagne z og d signal. I den nederste venstre panel er en afbildning af en repræsentativ kraft kurve, den maksimale indrykning af en fritbærende, hvoraf fjederkonstanten måles til at være 0.07N / m, er indstillet til at være 17 nm, således at den maksimale indrykning kraft, der udøves prøve er 1,2 nN. De vigtigste steder under indrykningen er markeret.

Protocol

1.. Kalibrer fjederkonstanten for Cantilever Indlæse cantilever i AFM henhold til producentens anvisninger. Det er nødvendigt at rense cantilever holderen med ethanol før eventuelle eksperimenter. Dette vil medvirke til at begrænse bakteriel forurening til kultur under AFM målinger. Kalibrer InvOLS (Inverse Optical Lever følsomhed). Dette parameter beskriver den mængde fotodiode reaktion (volt) pr nanometer af cantilever afbøjning. Indlæse en rent objektglas ned på prøven scenen…

Representative Results

2a viser tre repræsentative force kurver taget fra 3T3 fibroblaster dyrket på plastic overflade polyakrylamidgel af Youngs moduli 3.000 Pa og 17.000 Pa, hhv. Efter omhyggeligt at identificere de kontaktpunkter i kurverne, er indrykning kraft som funktion af celle deformation afbildet i figur 2b. Under en kraft størrelsesorden mindre end 0,3 nN, et pyramideform tip led 3 mikrometer i en celle dyrket på en 3 kPa polyacrylamidgel. I modsætning hertil er en kraft mere end 1,6 nN kræve…

Discussion

AFM indrykning metode har fordele ved at karakterisere mekaniske egenskaber af levende celler. Omend mindre følsomme end den magnetiske vride cytometri og optisk pincet, der kan måle kræfterne på piconewton level ^32, kan AFM detektere modstanden kraft fra prøver spænder fra snesevis af pico-Newton til hundredvis af nano-Newton, der kan sammenlignes med spænde af kraft, kan anvendes til celler ved hjælp af en mikropipette ^19.. Denne serie af force passer til de behov for at skabe målbare de…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO