O<em> Em ovo</em> CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma
Summary
O<em> In ovo</em> Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.
Abstract
Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos.
Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.
Introduction
Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia 1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro 3,4.
A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionados às características do comportamento do tumor no doente 5-7. A fim de tentar resolver estes problemas, a medicina personalizada ganhou em importância, o que se reflete no aumento da procura de modelos de xenoenxerto 8-12.
Um ensaio in vivo tem a vantagem de refletir a complexa interação entre cAncer células e para o ambiente de tecido do hospedeiro em tumores sólidos, necessários para a proliferação e invasão de 13 cancro. Atualmente, estudar o uso do ensaio de membrana cório-alantóide (CAM-ensaio) como um modelo de xenoenxerto reprodutível para sarcoma 14,15. Este teste é amplamente usado para o estudo da angiogénese tumoral 16,17. Na literatura, no entanto, encontrámos protocolos diferentes para este ensaio, enquanto que outros estudos observada uma marcada diferença no crescimento ou angiogénese de acordo com diferentes protocolos de 18,19.
Neste artigo, foi investigado o efeito da variação das condições do ensaio de CAM, no comportamento de células de tumor, utilizando enxertos de suspensões de células únicas derivadas de tumor e culturas de células de sarcoma estabelecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Momento da inoculação e da colheita
Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10.
Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Células da linha celular SW1353 condrossarcoma foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr. PCW Hogendoorn e Prof Dr. J. Bovée Universidade de Leiden, na Holanda. Agradecemos J. Mestach e G. Wagemans para uma excelente assistência técnica, e G. De Bruyne para o desenho profissional do panorama do nosso protocolo.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Riferimenti
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