ال<em> في البيضة</em> CAM-مقايسة باعتبارها Xenograftmodel عن الورم اللحمي
Summary
ال<em> في البيضة</em> مشيمائي غشاء (CAM) والمطعمة مع الطازجة أنسجة ساركوما المستمدة من الورم، ومعلقات من خلية واحدة، وfluorescently المسمى خطوط الخلايا ساركوما أنشئت دائمين ومؤقتين. يتم استخدام نموذج لدراسة الطعم (الملاءمة، ومؤشر انتشار Ki67، نخر، تسلل) والمضيف (تسلل الخلايا الليفية، نشوب الأوعية الدموية) السلوك.
Abstract
ساركوما هو مرض نادر جدا وهذا هو غير متجانسة في طبيعتها، جميع تعوق تطوير علاجات جديدة. مرضى ساركوما هي مثالية للمرشحين الطب الشخصي بعد التقسيم الطبقي، وشرح الفائدة الحالية في تطوير نموذج xenotransplant استنساخه ومنخفضة التكلفة لهذا المرض. فرخ مشيمائي الغشاء هو مضيف العوز المناعي الطبيعية قادرة على الحفاظ على الأنسجة والخلايا المطعمة دون قيود أنواع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الوصول إليه بسهولة، والتلاعب تصويرها باستخدام stereomicroscopy البصرية ومضان. يسمح الأنسجة مزيد من التحليل المفصل من التفاعلات الخلوية غيروي.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل في البيضة ترقيع لغشاء مشيمائي مع ساركوما المستمدة الطازجة أنسجة الورم، ومعلقات من خلية واحدة، وfluorescently المسمى خطوط الخلايا ساركوما أنشئت دائمين ومؤقتين (Saos-2 وSW1353). بقاء الفئران كتكوتES ما يصل الى 75٪. يتم استخدام نموذج لدراسة الطعم (الملاءمة، ومؤشر انتشار Ki67، نخر، تسلل) والمضيف (تسلل الخلايا الليفية، نشوب الأوعية الدموية) السلوك. لالمترجمة تطعيم تعليق خلية واحدة، ECM هلام ويوفر مزايا هامة على المواد الخاملة الاحتواء. ويرتبط مؤشر انتشار Ki67 إلى مسافة قريبة من الخلايا من سطح CAM ومدة التطبيق على CAM، وهذا الأخير تحديد إطار زمني لإضافة المنتجات العلاجية.
Introduction
ساركوما هو ورم نادر يصيب الأنسجة الضامة مع ارتفاع معدل الوفيات بسبب العلاج المقاومة 1،2. ويعيقه من التقدم في بقاء المريض بواسطة معدل الإصابة بها منخفضة السنوية وتنوعها واسعة، وحقيقة أن يتم الإبلاغ عن خلايا ساركوما أن يكون من الصعب للثقافة في المختبر 3،4.
كشفت استخدام الخلايا المستزرعة لتقييم العلاج قبل السريرية التي، على ما يبدو الجزيئات النشطة جديدة في المختبر لا تعكس دائما نتائج في الإعداد السريرية. وعلاوة على ذلك، الانحرافات الجينوم التي كشفت عنها صفائف التعبير الجيني ليست دائما مرتبطة إلى خصائص السلوك الورم في مريض 5-7. من أجل محاولة حل هذه المشاكل، وقد اكتسب الطب الشخصي في أهمية، وهو ما انعكس في زيادة البحث عن نماذج طعم أجنبي 8-12.
وهو في فيفو مقايسة لديه ميزة يعكس التفاعل المعقد بين جالخلايا ANCER والبيئة الأنسجة المضيفة في الأورام الصلبة، اللازمة لانتشار السرطان وغزو 13. حاليا نقوم بدراسة استخدام فحص غشاء المشيمي-السقاء (CAM-مقايسة) كنموذج طعم أجنبي استنساخه لساركوما 14،15. ويستخدم على نطاق واسع هذا الاختبار لدراسة الأوعية الدموية ورم 16،17. في الأدب، ومع ذلك، فقد وجدنا بروتوكولات مختلفة لهذا الفحص، في حين لوحظ دراسات أخرى اختلاف واضح في النمو أو الأوعية الدموية وفقا لبروتوكولات مختلفة 18،19.
في هذه المادة ونحن دراسة تأثير ظروف CAM-مقايسة متفاوتة على سلوك الخلية باستخدام الطعوم الورم، الورم المشتقة من تعليق خلية واحدة، وأنشأ الثقافات خلية ساركوما.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقت التلقيح والحصاد
توقيت تم تنفيذ يوم من التلقيح باستخدام SAOS2 في ECM هلام (36 الحدب) وتنوعت بين النهار التطور الجنيني 5 و 10.
قبل يوم والحضانة 9، كان لا CAM باستمرار كبيرة بما يكفي لدعم هلام ECM طبقنا. ع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت الخلايا من خط الخلية غضروفية SW1353 التكرم الأستاذ الدكتور PCW هوغندورن والأستاذ الدكتور J. Bovée من جامعة لايدن، هولندا. نشكر J. Mestach وG. Wagemans للحصول على مساعدة فنية ممتازة، وG. دي بروين للرسم المهنية لمحة عامة عن بروتوكول لدينا.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Riferimenti
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Ricerca sul cancro. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
