<em> באוב</em> CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה
Summary
<em> באוב</em> Chorioallantoic קרום (רמ"א) הוא מורכב עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, ושורות תאי סרקומה הוקמו כותרתו fluorescently קבועות וארעיות. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות.
Abstract
סרקומה היא מחלה מאוד נדירה שהיא הטרוגנית בטבע, כל פוגעות פיתוח הטיפולים חדשים. חולי סרקומה הם מועמדים אידיאליים לרפואה אישית לאחר ריבוד, המסבירים את הריבית הנוכחית בפיתוח מודל xenotransplant לשעתק ועלות נמוכה למחלה זו. קרום chorioallantoic החומוס הוא מארח immunodeficient טבעי מסוגלים לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא הגבלות מינים ספציפיות. בנוסף, ניתן לגשת בקלות, מניפולציות וצלם באמצעות stereomicroscopy אופטי וקרינה. היסטולוגיה נוספת מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות הסלולר heterotypic.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט באובו השתלה של קרום chorioallantoic עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, וקווים קבועים וארעיים שכותרתו fluorescently הוקמו סרקומה סלולרי (Saos-2 וSW1353). עכברוש הישרדות החומוסes הוא עד 75%. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות. להשתלה מקומית של השעיות תא בודדות, ECM ג'ל מספק יתרונות משמעותיים על פני חומרי בלימה אינרטי. מדד ההתפשטות Ki67 קשור למרחק של התאים מפני שטח של CAM ואת משך הזמן של יישום ברמ"א, שהאחרון קביעת מסגרת זמן לתוספת של מוצרים טיפוליים.
Introduction
סרקומה היא גידול נדיר של רקמות החיבור עם תמותה גבוהה בשל התנגדות 1,2 הטיפול. התקדמות בהישרדות חולה הקשתה על ידי שכיחותם הנמוכה השנתית, הגיוון הרחב שלהם, ואת העובדה שתאי סרקומה הם דיווחו להיות קשים לתרבות במבחנה 3,4.
השימוש בתאים בתרבית להערכת טיפול קליני גילו כי מולקולות חדשות, ככל הנראה פעילה במבחנה לא תמיד משקפות את התוצאות בסביבה הקלינית. יתר על כן, סטיות הגנום מתגלים על ידי מערכי ביטוי גנים הן לא תמיד קשורות למאפייני התנהגות סרטניים בחולה בודדת 5-7. על מנת לנסות ולפתור את הבעיות הללו, רפואה מותאמת אישית צברה בחשיבותו, אשר באה לידי ביטוי בחיפוש המוגבר לדגמי xenograft 8-12.
ב assay vivo יש את היתרון של המשקף הגומלין המורכב בין גתאי ancer וסביבת רקמת המארח בגידולים מוצקים, הנדרשים להתפשטות הסרטן והפלישה 13. נכון לעכשיו אנחנו לומדים את השימוש של assay ממברנה Chorio-allantoic (CAM-assay) כמודל לשחזור xenograft סרקומה 14,15. assay זה נעשה שימוש נרחב למחקר של אנגיוגנזה גידול 16,17. בספרות, לעומת זאת, מצאנו פרוטוקולים שונים עבור assay זה, בעוד שמחקרים אחרים שנצפו הבדל משמעותי בצמיחה או אנגיוגנזה על פי פרוטוקולים שונים 18,19.
במאמר זה אנו לחקור את ההשפעה של משתנה תנאים של CAM-assay על התנהגות תא סרטניים, באמצעות שתלי השעיות תא בודדות שמקורם בגידול בתרביות תאי סרקומה ומבוססות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זמן של חיסון וקציר
תזמון היום של חיסון בוצע באמצעות SAOS2 בECM ג'ל (36 מצלמות) ונע בין יום התפתחות העוברי 5 ו -10.
לפני הדגירה יום 9, CAM לא באופן עקבי היה גדול מספיק כדי לתמוך ג'ל ECM אנחנו מוחלים. בקציר, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תאים משורת תאי כונדרוסרקומה SW1353 נמסרו באדיבותו של פרופ 'ד"ר PCW Hogendoorn ופרופ' ד"ר י בובי של אוניברסיטת ליידן, הולנד. אנו מודים לג' וג' Mestach Wagemans לקבלת סיוע טכני מעולה, וג' דה Bruyne לציור המקצועי של הסקירה של הפרוטוקול שלנו.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Riferimenti
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Ricerca sul cancro. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
