<em> Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak> CAM-testi
Summary
<em> Ovo</em> Chorioallantoic membran (CAM), taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre hatları ile aşılanır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır.
Abstract
Sarkoma tüm yeni tedavilerin geliştirilmesi engel, doğada heterojen bir çok nadir görülen bir hastalıktır. Sarkom hasta bu hastalık için bir tekrarlanabilir ve düşük maliyetli kısenotransplant modeli gelişmekte olan cari faiz açıklayan, tabakalaşma sonra kişiselleştirilmiş tıp için ideal adaylardır. Civciv chorioallantoic membran türe özgü kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücrelerin sürdürülmesi yeteneğine sahip doğal bir bağışıklık sistemi zayıf ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, kolayca, erişilebilir manipüle ve optik ve floresan stereomikroskobi kullanarak görüntülü. Histoloji daha heterotipik hücresel etkileşimlerin detaylı analiz sağlar.
Bu protokol, detaylı şekilde açıklanmaktadır taze sarkomu türevli tümör dokuları, bunların tek hücre süspansiyonları, ve kalıcı ve geçici floresan etiketli Kurulan sarkoma hücre çizgileri (Saos-2 ve SW1353) ile korioallantoik membran aşılama ovo. Civciv hayatta kalma sıçanes% 75 kadar vardır. Modeli greft-(canlılığı, Ki67 proliferasyon indeksi, nekroz, infiltrasyon) ve ev sahibi (fibroblast infiltrasyonu, vasküler yapıdaki) davranışlarını incelemek için kullanılır. Tek hücre süspansiyonları aşılama lokalize için, ECM jel etkisiz altına malzemelere göre önemli avantajlar sağlamaktadır. Ki67 proliferasyon CAM yüzeyinden hücre mesafe ve CAM, terapötik ürünlerin eklenmesi için bir zaman dilimi belirlenmesi ikincisi uygulama süresi ile ilgilidir.
Introduction
Sarkomu tedavisi direnci 1,2 nedeniyle yüksek mortalite ile bağ dokularının bir nadir bir tümördür. Hasta hayatta ilerleme, düşük yıllık insidansı, onların geniş çeşitlilik ve sarkom hücreleri in vitro 3,4 kültür zor olduğu bildirilmektedir gerçeği ile engellenmektedir.
Klinik öncesi tedavi değerlendirmesi için kültür hücrelerinin kullanılması in vitro yeni, görünüşte aktif molekülleri her zaman klinik ortamda sonuçları yansıtmamaktadır ortaya koymuştur. Ayrıca, gen ifadesi diziler ortaya genom sapmaları her zaman 5-7 hasta tümör davranış özellikleri ile ilişkili değildir. Bu sorunları denemek ve çözmek için, kişiye özel tıp ksenogreft modelleri 8-12 için artan arama yansıtılır önem, kazanmıştır.
In vivo deney, bir C arasındaki karmaşık etkileşimi yansıtan avantajına sahiptirkanser proliferasyonu ve invazyonu 13 için gerekli ancer hücreleri ve solid tümörlerde konak doku ortamında,. Şu anda sarkomu 14,15 için bir tekrarlanabilir xenograft model olarak Chorio-alantoik Membran testi (CAM-testi) kullanımını incelemek. Bu deney, yaygın tümör anjiyojenezi 16,17 çalışma için kullanılmıştır. Diğer çalışmalarda farklı protokoller 18,19 göre büyüme ya da anjiyogenez belirgin bir fark gözlenmiştir ise literatürde, ancak biz, bu tahlil için farklı protokoller bulduk.
Bu yazıda tümör greft, tümör kaynaklı tek hücre süspansiyonları ve köklü sarkomu hücre kültürleri kullanarak hücre davranışı üzerindeki CAM-testinin koşulları değişen etkisini araştırmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşılama ve hasat zamanı
Aşılama yapıldığı gün ECM jel (36 CAM'lar) içinde SAOS2 kullanılarak yapılan ve embriyonik gelişim gün 5 ile 10 arasında değişiyordu zamanlama.
Kuluçka gün önce 9, CAM sürekli biz uygulanan ECM jel destekleyecek kadar büyük değildi. Hasat, tümör hücreleri bazen derin CAM alınan gerekiyordu ve bazı ECM jel örnekleri albümin ya da CAM gevşek yatıyorlardı. Gün 5 ve 6, bu civciv malformasyonlar veya ölüml…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SW1353 kondrosarkom hücre hattı hücreleri nazikçe Dr PCW Hogendoorn ve Leiden Üniversitesi, Hollanda Dr J. Bovee tarafından sağlandı. Biz protokol genel profesyonel çizim için J. Mestach ve G. Wagemans mükemmel teknik yardım için, ve G. De Bruyne teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Riferimenti
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Ricerca sul cancro. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
