Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato
Summary
Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.
Abstract
Leucina chinasi ricco ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi che condividono un dominio simile organizzazione, compreso un dominio chinasi serina-treonina, un complesso di Ras dominio proteine (ROC), un C-terminale del dominio ROC (COR), e ricco di leucina e ripetizioni ankyrin simile al N-terminale. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre LRRK2 è implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4. In questa relazione, vi presentiamo un protocollo per etichettare le proteine LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i livelli di fosforilazione complessivi di queste due proteine nelle cellule. In breve, l'affinità etichettato LRRK proteine sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo pochiore di incubazione e tutte le molecole nella cella contenente fosfati sono così marcato radioattivamente. Via il tag di affinità (3xflag) le proteine LRRK sono isolati dagli altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine sulle macchie. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorare la fosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione.
Introduction
Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi multidominio che condividono un'organizzazione dominio simile. Entrambe le proteine codificano una sequenza GTPasi simile alla famiglia di GTPasi Ras (Ras di proteine complesse, o ROC), nonché un terminale C della ROC dominio (COR), classificando efficacemente entrambe le proteine della famiglia di proteine ROCO 5,6. N-terminale del dominio tandem ROC-COR, entrambe le proteine codificare un dominio ripetizione ricca di leucina e un dominio ankyrin simile, mentre solo LRRK2 codifica un armadillo supplementare domein 6-8. C-terminale della ROC-COR, entrambe le proteine condividono un dominio chinasi serina-treonina mentre solo LRRK2 codifica un dominio WD40 nella regione C-terminale 8. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione 1,2, mentre evidenze genetica ad un ruolo per LRRK2 nella patogenesi della malattia di Parkinson 3,4.
<pclass = "jove_content"> La fosforilazione di proteine è un meccanismo di regolazione comune nelle cellule. Ad esempio, la fosforilazione può essere essenziale per l'attivazione di enzimi o per l'assunzione di proteine per un complesso di segnalazione. La fosforilazione cellulare di LRRK2 è stato ampiamente caratterizzato e mappatura phosphosite ha mostrato una maggioranza dei siti di fosforilazione cellulare a verificarsi in un cluster tra la ripetizione ankyrin e leucina domini ripetuti ricchi 9-11. Anche se LRRK1 siti di fosforilazione cellulare devono ancora essere mappato, evidenze da studi che utilizzano phosphoprotein colorazione delle macchie di proteine LRRK1 immunoprecipitata da cellule COS7 suggerisce che la proteina LRRK1 è fosforilata nelle cellule 12.Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity tagged LRRK prins sono espressi in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati sono così marcato radioattivamente. Il tag di affinità (3xflag) viene quindi utilizzata per isolare le proteine LRRK da altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia (32 segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine sulle macchie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento fornisce un protocollo di base per saggiare il livello di fosforilazione generale di LRRK1 e LRRK2 in linee cellulari mediante marcatura metabolica con 32 P-ortofosfato. La strategia generale è semplice. Affinity etichettato LRRK proteine sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente 32 P-ortofosfato. Il 32 P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo poche ore di incubazione e di tutte le molecole nella cellula contiene fosfati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo anche grati alla Michael J. Fox Foundation a sostegno di questo studio. Ringraziamo la Fondazione di Ricerca – Fiandre FWO (progetto FWO G.0666.09, ricercatore senior fellowship a JMT), l'IWT SBO/80020 progetto Neuro-TARGET, la KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) per il loro sostegno. Questa ricerca è stata sostenuta anche in parte dal Fondo Druwé-Eerdekens gestiti dalla Fondazione Re Baldovino a JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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