يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا^{2 +} وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Summary

تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا ^{2 +،} sphingomyelinase والعوامل الأخرى على إصلاح غشاء البلازما.

Abstract

إصابة غشاء البلازما هو الحدث بشكل متكرر، والجروح يتعين إصلاحه بسرعة لضمان البقاء على قيد الحياة الخلوية. تدفق كا ^{2 +} هو حدث يشير المفتاح الذي يقوم بتشغيل إصلاح الجروح الميكانيكية على غشاء البلازما داخل ~ 30 ثانية. وكشفت الدراسات الحديثة أن خلايا الثدييات أيضا ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع المسام تشكيل السموم في كا ^{2 +} التي تعتمد على عملية ينطوي على إيماس من sphingomyelinase حمض انزيم الليزوزومية تليها المسام الإلتقام. هنا، نحن تصف المنهجية المستخدمة لإثبات أن إعادة عزل الخلايا permeabilized من قبل O السم ستربتوليزين هو أيضا سريع وتعتمد على كا ^{2 +} تدفق. تصميم مقايسة يسمح تزامن هذا الحدث الضرر وقياس الحركية الدقيقة للقدرة الخلايا على استعادة سلامة غشاء البلازما عن طريق التصوير وقياس مدى الذي الصبغة liphophilic FM1-43 تصل إلى أغشية الخلايا. هذا المرض فحص الحيةس يسمح بتقييم الحساسة من قدرة خارجيا أضاف العوامل القابلة للذوبان مثل sphingomyelinase لمنع تدفق FM1-43، مما يعكس قدرة الخلايا على إصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم. يسمح هذا الاختبار لنا لإظهار للمرة الأولى التي sphingomyelinase يعمل المصب من كا ^{2 +} إيماس التي تعتمد، منذ بالإضافة خارج الخلية من الانزيم يعزز إعادة عزل الخلايا permeabilized في غياب كا ^{2 +.}

Introduction

وقد كان من المعروف لعدة عقود أن إصلاح غشاء البلازما بعد الإصابة الميكانيكية هو ^1،2 كا ^{2 +} التي تعتمد عملية. وأظهرت الدراسات فيما بعد أن كا ^{2 +} تدفق من خلال الجرح يطلق عملية نشطة من إيماس من الحويصلات داخل الخلايا في موقع الإصابة، وهو مطلوب لإعادة عزل ^3،4. تم استخدام معدل فقدان صبغة الفلورسنت تحميلها في سيتوبلازم الخلايا لتقييم سرعة إصلاح، وخلص إلى أن اكتمل إعادة عزل داخل <30 ثانية بعد الإصابة ^5. واقترحت في البداية نموذجين لشرح متطلبات إيماس في إصلاح غشاء البلازما: 1) نموذج "التصحيح"، مما يوحي بأن كا ^{2 +} تدفق من خلال الآفة يؤدي الانصهار في البداية مثلي النمط من الحويصلات داخل الخلايا، وتشكيل كبير "التصحيح" التي من شأنها أن ثم تطبيقها على غشاء البلازما لختم الجرح ⁶ و 2) نموذج خفض التوتر، الذي اقترح أن غشاء عديد بواسطة كا ^{2 +} إيماس التي تعتمد في محيط الجرح من شأنه أن يقلل التوتر غشاء البلازما، وتسهيل إعادة إغلاق طبقة ثنائية ^7. وقد تعزز دور كا ^{2 +} إيماس أثار في البلازما إصلاح غشاء مزيدا من الدراسات التي تبين أن الجسيمات الحالة تحتوي على جزيء كا ^{2 +} الاستشعار، synaptotagmin السابع، مما يسهل إيماس والبلازما إصلاح غشاء الخلايا المصابة في ^8،9،10،11 .

ومع ذلك، فقد أشارت الأدلة الإضافية التي إيماس وحده لم يكن كافيا لتعزيز إصلاح غشاء البلازما. بالإضافة إلى الدموع الميكانيكية على غشاء البلازما، وهو شكل المتكرر للإصابة الخلية هو permeabilization بواسطة السموم تشكيل المسام التي تنتجها البكتيريا ^12،13 أو ^14،15 الخلايا المناعية. على عكس الدموع الميكانيكية والبروتينات المكونة للمسام إدراج نفسها على غشاء البلازما تشكيل مستقرة، المسام مبطنة البروتين الذي لا يمكن أن يتم إغلاقه ببساطة عن طريق تطبيق غشاء "التصحيح" أو احمرارجي التوتر الغشاء. يثير الاهتمام والفضول، وكشفت الدراسات أن خلايا الثدييات لديها آلية فعالة لإصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع البروتينات التي تشكل المسام، وهذه العملية تتطلب أيضا وجود خارج الخلية كا ^{2 + 12.} أثارت هذه النتيجة مسألة ما إذا كان إزالة الغشاء مسام من سطح الخلية أيضا عملية سريعة، كما لوحظ مع الجروح الميكانيكية ^5. من المستغرب، كشفت الدراسات التي أجريناها مؤخرا أن إعادة عزل الخلايا permeabilized مع السموم تشكيل المسام لها خصائص مشابهة جدا لإصلاح الجروح الميكانيكية: تتطلب عملية خارج الخلية كا ^{2 +،} وتكتمل في غضون 30 ثانية ~. التحقيق هذه العملية في مزيد من التفاصيل، علمنا مؤخرا أنه بالإضافة إلى كا ^{2 +} إيماس تنظيما من الجسيمات الحالة، ينطوي إصلاح غشاء البلازما شكل السريع لالإلتقام، والتي يتم تشغيلها من قبل الإفراج عن انزيم الليزوزومية sphingomyelinase حمض (ASM) وضروري ليس فقط لعشرإزالة (ه) من المسام عبر الغشاء، ولكن أيضا لإصلاح الجروح الميكانيكية ^16.

لتحديد حركية إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، في المختبر لدينا نحن تكييفها منهجية التصوير الحية التي كانت تستخدم في السابق لتقييم إعادة إغلاق ألياف العضلات المعزولة بجروح الليزر ^17. يعتمد هذا الاختبار على خصائص صبغ محبة للدهون FM1-43، والتي intercalates ثابت في النشرة الخارجي من طبقات ثنائية الدهون وزيادة في كثافة مضان. عندما تعطل البلازما طبقة ثنائية الغشاء مكاسب صبغ خارج الخلية أغشية الخلايا الوصول إلى، وتوفير الفحص الحساسة للكشف عن إصابة غشاء البلازما وإصلاح ^{18،16،19،20.} للتكيف مع هذا الاختبار لتقييم إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، ونحن الخلايا ما قبل المحتضنة في 4 درجات مئوية مع السم البكتيري ستربتوليزين O (سلوفاكيا)، الذي يربط لغشاء الكولسترول ^21. خلية متزامنويمكن بعد permeabilization أن يتحقق بسهولة عن طريق نقل الخلايا من الجليد لتدفئة المتوسطة في مرحلة المجهر ساخنة، والتي ينشط oligomerization والتغيير في التشكل الذي يؤدي إلى تشكيل المسام عبر الغشاء. ميزة هذا النهج، على المقايسات التي تم نشرها مسبقا باستخدام الليزر جرح، غير أن عددا أكبر من الخلايا يمكن تحليلها في وقت واحد في حقل المجهرية، وتوفير أفضل أخذ العينات من السكان الخلية. نظرا للتشابه بين الآلية عملية إعادة عزل الخلايا ينظر بعد الإصابة الميكانيكية وpermeabilization مع السموم تشكيل المسام، مقايسة وصفنا هنا يوفر طريقة مرنة للغاية وقوية لتشريح العوامل التي تدخل في عملية الأساسية للإصلاح غشاء البلازما. كمثال على ذلك، وتبين لنا أنه من الممكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الخطوات كا ^{2 +} التي تعتمد ومستقلة عن عملية الإصلاح.

Protocol

1. النسخي إسكات ASM البذور 1.5 × 10 5 خلايا هيلا في 2 مل من وسائط النمو DMEM (DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ بنسلفانيا-بكتيريا) على الأطباق 35 ملم أسفل الزجاج (ماتيك) و احتضان بين عشية وضحاها ?…

Representative Results

تركيزات منخفضة من البكتيريا البلازما sphingomyelinase (SM) الانقاذ إصلاح الغشاء في الخلايا المنضب في sphingomyelinase حمض الليزوزومية. باستخدام FM1-43 فحص التصوير، وأظهرنا سابقا أن الخلايا ناقصة لASM انزيم الليزوزومية وتعرضت لاصابة في سلوفاكيا وجود ?…

Discussion

اعتمدت الدراسات السابقة على الإصابة الميكانيكية وإصلاح غشاء البلازما على آليات متنوعة من الخلايا جرح، بدءا من إسقاط الخرز الزجاجي، micropipetting، القص، خدش أو كشط. كانت قراءات من كل هذه المقايسات النوعية بدلا من الكمية، ولم تعطي معلومات دقيقة عن حركية آلية إصلاح. تم قياس …

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber