En human<em> Ex Vivo</em> Aterosklerotisk plaque Model til Studieinformationen Læsionssynligheden Biologi

Summary

Atherosklerose er en kronisk inflammatorisk proces. Dette håndskrift illustrerer en nem at bruge ex vivo model for at undersøge frisk carotis eller koronar plaques. Den ex vivo model giver mulighed for undersøgelse af potentielle stoffer på det inflammatoriske miljø i humane aterosklerotiske læsioner og resultaterne kan analyseres ved forskellige metoder.

Abstract

Atherosklerose er en kronisk inflammatorisk sygdom i karrene. Der er forskellige metoder til at studere inflammatorisk forbindelse i atherosklerotiske læsioner. Musemodeller er et vigtigt redskab til at undersøge inflammatoriske processer i atherogenese, men disse modeller lider af fænotypiske og funktionelle forskelle mellem murine og humane immunsystem. In vitro celle eksperimenter anvendes til specifikt at evaluere celletypeafhængig ændringer forårsaget af et stof, interesse, men kultur-afhængige variationer og den manglende evne til at analysere indflydelsen af ​​specifikke molekyler i forbindelse med den inflammatoriske forbindelse i atherosklerotiske læsioner begrænse virkningerne af resultaterne. Desuden at måle niveauet af et molekyle af interesse i humant blod bidrager til yderligere at undersøge den kliniske relevans, men dette repræsenterer systemisk og ikke lokal inflammation. Derfor har vi her beskrive en mindeplade kultur model til at studere menneskelig ateroskleroselæsion biologiex vivo. Kort sagt, friske plaques indhentet fra patienter, der gennemgår endarterectomy eller koronar arterie bypass transplantation og opbevares i RPMI medium på is indtil brug. Prøverne skæres i små stykker efterfulgt af tilfældig fordeling i en 48-brønds plade, der indeholder RPMI medium i tillæg til en substans af interesse, såsom cytokiner eller kemokiner alene eller i kombination for definerede perioder. Efter inkubation kan plak stykker blive chok frosset til mRNA isolation, indlejret i paraffin eller OLT for immunhistokemisk farvning eller smadret og lyseres for western blotting. Endvidere kan celler isoleret fra plaque til flowcytometri-analyse. Desuden kan supernatanter opsamles til protein måling ved ELISA. Som konklusion åbner den præsenterede ex vivo-model muligheden for yderligere at undersøge inflammatoriske lesional biologi, hvilket kan resultere i identifikation af hidtil ukendte sygdomsmekanismer og terapeutiske mål.

Introduction

Aterosklerose som en kronisk inflammatorisk sygdom er en af de vigtigste dødsårsager i industrialiserede nationer ^1-2. Komplikationer af åreforkalkning, især akut koronar syndrom, har været knyttet til sprængning af sårbare læsioner, der forårsager aterotrombose og karokklusion ^3. Medfødte og adaptiv immunitet synes at være involveret i alle trin af atherogenese ^2,4-5. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i behandlingen af ​​myokardieinfarkt, effektiv forebyggelse af åreforkalkning og uønskede kardiovaskulære hændelser er stadig uløste. Således studerer lesional biologi er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af ​​åreforkalkning og for at muliggøre identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye behandlingsformer.

I mange tilfælde er murine modeller anvendt til at undersøge patofysiologien af ​​specifikke sygdomme. Men studerer atherogenese hjælp musemodeller er accompanied af flere begrænsninger: (1) Normalt atherosklerotiske mus modtager en diæt med højt cholesterolindhold. Kolesterol i disse modeller ikke kan sammenlignes med dem i patienter med forhøjede kolesteroltal serumniveauer ^6. (2) Der er væsentlige forskelle mellem murine og humane immunsystem; således foxp3 er en specifik markør af murine regulatoriske T-celler, hvorimod menneskelig foxp3 ekspression i humane T-celler ikke nødvendigvis giver en regulerende fænotype ^7. Også den Th1/Th2 paradigme, som defineret i mennesker er ikke fuldt ud overføres til murine T-celler. (3) En række markører, der anvendes til at identificere murine monocytter og makrofager såsom F4/80 og markører for klassisk (M1) vs alternativ (M2) aktiveringsmønstre findes ikke i humane myeloide celler ^8. (4) Genekspression af murine og humane monocytter fra perifert blod er blevet fundet at være væsentligt forskellige ^9.

Således, for at øge forståelsen afkroniske inflammatoriske processer i menneskelig åreforkalkning, er vi nødt til at gøre brug af modeller, der arbejder med humant væv, blod eller celler. Her beskriver vi en model af den menneskelige plak vævskultur, hvilket giver undersøgelsen af ​​mulige nye stoffer i begrebet menneskelig inflammatoriske lesional biologi.

Protocol

1.. Forbered medium som følger Culture Medium: RPMI-medium. Tilsæt 10% føtalt kalveserum (FCS). Tilsæt 100 U / ml penicillin G og 100 g / ml streptomycin. 2.. Opbevaring af frisk plak cylinder indtil anvendelse Carotis endarterectomy operation af patienter med eller uden iskæmiske symptomer (slagtilfælde, forbigående iskæmiske anfald) med en betydelig halspulsåren stenose vil ske ved karkirurger og kranspulsåren endarterectomy under k…

Representative Results

Her præsenterer vi en række figurer, der viser resultaterne af ex vivo plak dyrkning. At vurdere ændringer i det inflammatoriske miljø i respons til agenten af interesse i ex vivo model eksperiment måler vi forskellige molekyler, der er kendt for at være primært involveret i atherogenese. Som repræsentative pro-atherogene cytokiner vi vælger TNFa, IL6 og IFNg 2,11. Derudover bruger vi von Willebrand faktor og vævsfaktor at evaluere pro-thrombotiske ændringer. Desuden til at tage u…

Discussion

Her præsenterer vi en ex vivo plak kultur model til at undersøge indflydelsen af potentielt relevante stoffer på ateroskleroselæsion biologi. Den største fordel ved denne ex vivo-fremgangsmåde er evnen til at vurdere indflydelsen af angivne stoffer inflammatoriske celler og deres cellulære samspil samt inflammatoriske veje og kaskader i humane atherosklerotiske læsioner. Adskillige brugbare metoder (fx RT-PCR, western blot, immunhistokemi, flowcytometri, ELISA) hjælp til at give en sa…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Gibco	21875-091	n/a
FCS	Gibco	10270-106	n/a
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458	n/a
15 ml tube	Sarstedt	62,554,502	n/a
culture dish (60mm)	Orange Scientific	5550200	n/a
LPS	Sigma	L4516	n/a
Cell Culture Plates 48-well	Greiner	677102	n/a
Scalpel – single use	Feather	FEA200130011	n/a
TissueLyser	Precellys 24 Dual	Cat. No. EQ03119.200.RD010.0	n/a
RNeasy (Mini) Kit	Qiagen	Cat. No. 74104	n/a
Boehringer cDNA kit	Roche Diagnostics	Cat. No. 11483188001	n/a
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific		n/a