Isolering af sensoriske neuroner i<em> Aplysia californica</em> For patchclamp Optagelser af glutamaterge strømforhold
Summary
Vi beskriver dissektion af nervesystemet af havmiljøet søharen<em> Aplysia</em> Efter anæstesi. Isolering af neuroner til kortvarige-vævskultur, og optagelser af encellede ionstrømme via patch clamp teknik
Abstract
Det marine havsnegle mollusk Aplysia californica har en ærværdig historie som en model af nervesystemet funktion, med særlig betydning i studier af indlæring og hukommelse. De typiske forberedelser til sådanne undersøgelser er dem, hvor sensoriske og motoneurons er tilbage intakt i en minimalt dissekeret dyr eller en teknisk kompliceret neuronal co-kultur for individuel sensoriske og motoneurons. Mindre almindelige er den isolerede neuronal forberedelse, hvor små klynger af nominelt homogene neuroner er dissocieret til enkelte celler i kort sigt kultur. Sådanne isolerede celler er anvendelige til biofysiske karakterisering af ionstrømme med patch clamp teknikker og målrettet modulering af disse konduktanser. En protokol til fremstilling af sådanne kulturer er beskrevet. Protokollen tager fordel af de let identificerbare glutamaterge sensoriske neuroner i pleural og bukkale ganglier og beskriver deres afstandtagen og minimal vedligeholdelse in kultur i flere dage uden serum.
Introduction
De marine opistobranch mollusk, Aplysia har været et nyttigt neurobiologiske model i mange årtier. Det er bedst kendt som en model for tilvænning og klassisk konditionering 7, 8. Undersøgelser på indlæring og hukommelse i denne model vandt Nobelprisen i fysiologi eller medicin i 2000 for Eric R. Kandel, i en præmie han delte med Arvid Carlsson og Paul Greengard 10.. Undersøgelser, der involverer elektriske optagelser fra reducerede præparater, hvor elementer i nervesystemet denne hvirvelløse dissekeres fra dyret med nerver og muskler forlod tilknyttet, har hjulpet belyse roller enkelte neuroner i Aplysia. Identifikation af præcise molekylære mekanismer, der udgør læring i Aplysia dog ofte beskæftiget anden teknik langsigtede co-kulturer af en sensorisk neuron og en motoneuron, opnået en efter en fra individuelle donordyr og tilladt at danne en synapse i dyrkningsskålen 21 .
Vi og andre 1, 3, 6, 14, 15, har 16 udnyttet den lethed, hvormed identificerede neuroner kan målrettes i denne model samt deres udholdenhed i langsigtede eksperimenter at gøre dissocierede kortsigtede kulturer af klynger af nominelt homogene neuroner hvor vi studere ionstrømme under spænding klemme i patch-clamp-konfiguration. Mange Aplysia neuroner stå op til gentagne runder af patch fastspænding at give tid til langvarige eksperimentelle manipulationer. Teknikken er nyttig til neuroner såsom neurosekretionsceller pose celler abdominale ganglion, og de sensoriske neuroner pleura og bukkale ganglier hvis dissociation vi beskriver her, men ikke for meget store neuroner> 60 um diameter, såsom L7 eller R2 i abdominal ganglion. Vi ansætter ikke Aplysia serum i vores kulturer, i modsætning til de sensorisk-motoneuron co-kulturer beskrevet andetsteds. De fleste neuroner opnået ved hjælp af denne procedure vil være uden processer til than først 48 timer i kultur, lette hel celle spænding optagelse, men vil så spire og uddyber axoner og andre processer til cirka 14 dage før at dø af mangel på næringsstoffer og / eller vækstfaktorer.
Denne teknik producerer primære kulturer af 50-100 neuroner pr skål fra fysiologisk dokumenterede områder af mundhulen og pleural ganglier. Denne protokol er nyttig for forskere studerer aspekter af enkelt celle fysiologi i eksperimenter, der kræver talrige forsøgsgentagelser per dyr. Det producerer en udparret kulturer på grund af anatomiske adskillelse af målcellerne i venstre og højre hemiganglia, tillader undersøgelser, der nyder godt matchede behandling kulturer og kontrolkulturerne.
Protokollen mål buccale S klynge (BSC) neuroner i mundhulen ganglion og pleurale ventrocaudal (PVC) neuroner i pleural ganglion. Disse celler er en passende størrelse for hele cellespændingsværdier optagelser og display Robust glutamaterge responses. Den diskuterede metode er passende for de fleste ganglier i Aplysia nervesystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dissociationen teknikker beskrevet her, giver sensoriske neuron kulturer indeholdende 50-100 isolerede neuroner spækket med små antal af glia og andre uidentificerede celler. De mest kritiske trin i protokollen er det tidspunkt, hvor ganglier forblive i enzym-løsning, og zappe, dissociation af de spaltede celleklynger at bryde ud klyngen i individuelle celler. Fordøjelse (trin 1.8) skal optimeres ved den tilgængelige temperatur. Ved 23 ° C med langsom rystning, 13 hr er tilstrækkelig til fordøjelse af BSC klynge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieret af NIH P40 OD010952 den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship til SLC og et Maytag stipendium til at ATK. Forfatterne takker personalet for National Resource for Aplysia samt Lauren Simonitis og Hannah Peck, der leverede mikrografier til en figur.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Riferimenti
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
