合成、細胞の配送および<em>インビボ</em>デンドリマーベースのpHセンサの応用

Summary

蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。

Abstract

蛍光指示薬の開発は、生命科学のための革命を表していた。遺伝的にコードされたと検知能力を持つ合成フルオロフォアは、高い空間分解能と時間分解能との生物学的に関連の種の可視化を可能にした。合成染料は、その高い同調性と測定可能な分析物の広い範囲に特に関心のおかげである。しかし、これらの分子は、低分子の挙動（溶解度が低い、ターゲット設定の難しさ、許可された多くの場合、無レシオイメージング）に関連するいくつかの制限を受ける。本研究では、デンドリマーベースのセンサの開発を紹介し、生細胞及びin vivoで、in vitroで pH測定のための手順を提示する。我々はそれらのいくつかの生物医学機器に広く使用される足場た彼らの多くの望ましい特性（単分散性、波長可変特性、多価性）のために私たちのセンサーのための理想的なプラットフォームとしてデンドリマーを選択します。蛍光のpHの抱合デンドリマー骨格にインジケータが彼らのセンシング性能の向上につながった。特に、デンドリマーの展示は、セルの漏れを低減し、細胞内ターゲティングを改善し、レシオメトリック測定が可能です。これらの新規なセンサは正常マウス脳におけるHeLa細胞を生体内及び生体内の pHを測定するために使用した。

Introduction

特定の生体関連分子を標識するための蛍光分子の使用は完全に我々は生物学的システムを研究方法を変更しました。広視野と共焦点顕微鏡は、生物学的プロセスをリアルタイムで高解像度の可視化のために許可されたと、最近の細胞およびin vivoでのin vitroでの生物学的事象を研究するための最も人気のあるテクニックの一つです^。1関連の改善は、蛍光指標の開発で表したその蛍光の特定の分子実体の濃度に依存する、 すなわち染料。 pHとカルシウムの指標は特に起因する生物学において、H ⁺およびCa ^{2 +}イオンの膨大な関連性に細胞生理学の研究に大きな影響を与えた^。2,3

細胞内のtargetiにおけるI）難しさ：ただし、本センシング染料のほとんどいくつかの固有の制限は、次のような彼らの低分子行動に関連NGと、ii）水への溶解度が低い、その結果、貧困層、生体適合性、およびiii）細胞漏れ、したがって長期タイムラプスイメージング能力の欠如^4はさらに、多くのプローブの信号は色素濃度への依存のために補正することができない（非。レシオメトリックイメージング）、したがって、細胞またはin vivoで絶対的な測定は不可能である。

我々は最近、デンドリマー骨格上の感知色素のコンジュゲーションに基づき、これらの制限を克服するための簡単で効果的な方法論を説明した図⁵デンドリマーは、生物学的用途のための非常に魅力的な特性を有する単分散ハイパーブランチポリマーであり、特に^6は、複数の樹状アーキテクチャが開発され、使用されている薬剤⁷および遺伝子送達のために^。8ごく最近になっていくつかのグループは、センシングデバイス用の足場として、これらの分子の可能性を探求し始めた^。9,10,11

私たちは、以前にNHS-活性化エステルに基づく異なるポリアミドアミンの官能化に向けて容易に合成経路（PAMAM）足場を説明したコンジュゲート¹²のみを精製などの透析により単一工程で得ることができる。興味深いことに、このアプローチは容易に樹枝状またはポリマー足場、種々に適用することができる^。13,14

i）のpH指示薬（ すなわち、フルオレセイン）およびii）pH依存性蛍光部分（ すなわち、ローダミン）：レシオメトリックイメージングデンドリマーを達成するために二重標識色素の2セットであった。これは、フルオレセインおよびローダミンとの比はpHにし、これ以上のプローブの濃度にのみ依存しているように我々に正確なpHの撮影を行うことができました。寿命は、その測定値が、レシオメトリック補正を必要としないプローブ濃度に依存しないように、この問題へのもう一つの興味深いアプローチは寿命ベースのプローブを使用する^。15で表されます。しかし、LIFetimeの測定は、より複雑な楽器のセットアップを必要とし、それらの時間分解能は、従って、それらの潜在的用途を限定する、高速な生理的プロセスのために準最適である。

細胞内イメージングを行うために、プローブは、サイトゾルに原形質膜を横切って配信する必要がある。デンドリマーは、それらの大きさおよび親水性のために、膜透過されないように、細胞内送達は、エレクトロポレーションを介して達成することができる。この技術により、トランスフェクションのために広く使用される生物学において、標識された巨大分子を効果的に高品質のイメージングを行うために細胞内に送達することができる。巨大分子が直接細胞質に送達されるようにまた、エレクトロポレーションによりデンドリマーエンドサイトーシスに関連した合併症を回避することができる。興味深いことにエレクトロポ異なるデンドリマーの後でもシーケンスを対象とした全ての特定の非存在下では細胞内の個別のローカライズを示しています^。5このPASSIVEのみによりデンドリマーの物理化学的特性のために、ターゲットに、オルガネラ特異なpHイメージングを実現するために悪用される可能性があります。

レシオメトリックイメージング、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。共有結合した樹状足場に結合させ、フルオレセインおよびローダミンは、別々に画像化したと画素ごとの比マップが作成されました。イオノフォアを用いて生細胞における細胞内pHを制御するために、いくつかの手順が報告された。イオノフォアは、原形質膜を横切ってイオンを輸送することができる小さな疎水性分子であり、H ⁺イオンに対するイオノフォア、例えば、ナイジェリシンとして、入手可能であり、デンドリマーベースのセンサを較正するために使用することができる¹⁶これらの測定値を観察したものに同様にpHに線形応答を明らかにした。 in vitroで 。較正細胞内のpHに基づいて正確に測定することができる。これらの測定は、デンドリマーベースのセンサーは、研究H ⁺ homeost貴重なツールになり得ることを示し生きた細胞およびpH調整の誤動作を伴う病理学的プロセスにおいてASIS。

我々は最近、デンドリマーベースのpHセンサーは、麻酔したマウスの脳におけるpHの撮影を行う、 生体内でも適用することができることを実証した^。17により生体組織の複雑な環境へのインビボ検出の高い品質が技術的に困難である。ここでは、脳内の正確なpHイメージングを実行するために取り組むべき重要な課題の重点を置いて、生体内のpHイメージングのための実験手順の詳細な説明を表示。二光子顕微鏡法は、2つの主な理由のために使用されている：i）の赤外光の使用は、標準的な共焦点顕微鏡の組織浸透性の欠如を克服することを可能にすること、ii）フルオレセインおよびローダミンの広い二光子吸収は、それらの同時励起を回避することを可能励起用2波長の使用に関連する合併症。マウス脳におけるpH測定であった正常に実行、センサーが容易に脳細胞外空間中のpHの変化を誘導する低酸素状態に応答します。これらの測定は、デンドリマーベースのインディケータが正常動物モデルにおけるin vivoでのpHの生理学的および病理学的変化を強調するために使用できることを実証している。

Protocol

1。センサーの合成次のセクションでは、PAMAMデンドリマーにpH指示薬の結合のための手順を提供する。同一のプロトコルは、代替のアミン含有デンドリマーに最少の改変を適用することができる。5,17,13,14、市販のデンドリマーおよび染料をさらに精製することなく使用することができる。 無水DMSO（50μM最終濃度）にデンドリマーを溶かす。無水DMSOフルオレセインNHSお?…

Representative Results

図1は、異なる樹状足場に染料を感知するのコンジュゲーションの概略図を示す。得られた指標は、市販品から1つの合成工程で容易に得ることができる。アミン含有デンドリマーはDMSO中のNHS-活性化色素と反応させ、透析によって精製される。この一般的な手順は、すでに成功して、いくつかのデンドリマーの標識に使用されました。I）PAMAMデンドリマー世代2、4、6、12、</sup…

Discussion

デンドリマーベースのセンサとの正常なpHイメージングのための重要なステップは次のとおりです。I）正しい樹状足場の選択と、それに結合させ指標の数や細胞内や生体内でのセンサ配信プロトコルのII）は、最適化。

合成手順は非常に簡単であり、すべてのアミン持つハイパーブランチポリマーに仮想的に適用することができます。センサは、単一のステ…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500