Sentez, Hücresel Teslimat ve<em> In vivo</em> Dendrimer tabanlı pH Sensörlerin Uygulamaları
Summary
Floresan sensörler yaşam bilimleri güçlü araçlardır. Burada sentez ve canlı hücreler içerisinde ve in vivo olarak pH ölçmek için dendrimer bazlı flöresanlı sensörleri kullanmak için bir yöntem tarif eder. Dendritik iskele gelişmiş algılama özelliklere yol açmaktadır konjuge floresan boyaların sağlayıcı özelliklerini de arttırır.
Abstract
Floresan göstergelerin geliştirme yaşam bilimleri için bir devrim niteliğindeydi. Genetik olarak kodlanmış ve algılama yetenekleri ile sentetik flüoroforlar yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik ilgili türlerin görselleştirme izin verdi. Sentetik boyalar yüksek Ayarlanabilirliğin ve ölçülebilir Analitlerin geniş özellikle faiz sayesinde vardır. Ancak, bu moleküller (zayıf çözünürlük, hedefleme zorluklar, genellikle hiçbir rasyometrik görüntüleme izin) küçük molekül davranışı ile ilgili çeşitli sınırlamalar muzdarip. Bu çalışmada, biz dendrimer bazlı sensörler gelişimini tanıtmak ve canlı hücreler ve in vivo, in vitro olarak pH ölçümü için bir yöntem sunulmaktadır. Biz onları birkaç biyomedikal cihazlar için yaygın olarak kullanılan iskele yaptıkları çok arzu edilen özellikleri (monodispersiteye, ayarlanabilir özellikleri, çok değerlilik) için bizim sensörler için ideal bir platform olarak dendrimerlerinde seçin. Floresan pH konjugasyondendrimer iskele için göstergeler kendi algılama performansları bir donanıma yol açtı. Özellikle dedrimerler sergi hücre kaçağı, gelişmiş hücre içi hedefleme ve rasyometrik ölçümlerine izin azalır. Bu yeni sensörler başarılı bir HeLa canlı hücreler ve fare beyninde in vivo olarak pH ölçmek için kullanılmıştır.
Introduction
Belirli biyolojik ilgili molekülleri etiketlemek için floresan moleküllerin kullanımı tamamen biz biyolojik sistemlerin çalışma şeklini değiştirdi. Widefield ve günümüzde gerçek zamanlı yüksek çözünürlüklü biyolojik süreçlerin görselleştirme ve izin konfokal mikroskopi hücrelerinde in vivo ve in vitro biyolojik olayları incelemek için en popüler teknikleri arasında yer almaktadır. 1 A İlgili iyileştirme floresan göstergelerin geliştirilmesi tarafından temsil edildi , olan floresan belirli bir moleküler varlığın konsantrasyonuna bağlıdır, yani boyalar. Özellikle pH ve kalsiyum göstergeleri nedeniyle H + ve Ca biyoloji 2 + iyonları büyük alaka hücre fizyolojisinin çalışmanın üzerinde dramatik bir etkisi vardı. 2,3
Hücre içi targeti i) zorlukları: Bununla birlikte, bu algılama boyaların çoğu birkaç iç sınırlamaları gibi, küçük molekül davranışa ilişkinng; su ve dolayısıyla fakir biyouyumluluktaki ii) kötü çözünürlüğü;. ve iii) hücre kaçak ve uzun zaman atlamalı görüntüleme yeteneği 4 böylece eksikliği Ayrıca, birçok prob sinyal boya konsantrasyonuna bağımlılığı için düzeltilmiş olamaz (non- rasyometrik görüntüleme) ve bu yüzden, hücreler ya da in vivo mutlak ölçüm mümkün değildir.
Yakın zamanda bir dendrimer iskele üzerinde algılama boyaların konjugasyonu göre, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için, basit ve etkili bir yöntem tarif. Dendrimerler 5 biyolojik uygulamalar için çok çekici özellikleri olan tek dağılımlı aşırı dallı polimerlerdir. Özellikle 6 birkaç dendritik yapılanma da gelişmekte ve kullanılmış olan İlacın 7 ve gen teslimat için. 8 Sadece çok yakın birkaç grup algılama cihazları için iskele olarak bu moleküllerin potansiyelini keşfetmeye başladım. 9,10,11
Daha önceNHS-aktive edilmiş esterler ile ilgili olarak farklı poliamidoamin fonksiyonelleştirilmesi karşı kolay sentetik yol (tein) iskeleler tarif. 12 konjugatları, sadece saflaştırma gibi diyaliz vasıtasıyla tek bir aşamada elde edilebilir. İlginç bir şekilde bu yaklaşım kolayca dendritik ya da polimerik iskelelerinin çeşitli uygulanabilir. 13,14
I) bir pH göstergesi (örneğin fluoresein) ve ii) bir pH-bağımsız bir floresan parçası (örneğin rodamin): rasyometrik dendrimerlerinden görüntüleme elde etmek için, çift etiketli boyaların iki grup idi. Bu bizi flöresin ve rodamin arasındaki oran pH değerine sadece bağlıdır ve daha fazla prob konsantrasyonuna kadar doğru pH görüntüleme gerçekleştirmek için izin verdi. Ömür boyu bu ölçümler bir rasyometrik düzeltme gerekmez prob konsantrasyonuna bağlı değildir gibi bu konuya bir başka ilginç yaklaşım, yaşam boyu-temelli probların kullanımı. 15. tarafından temsil edilmektedir. Bununla birlikte, lifetime ölçümleri daha karmaşık bir enstrümantal kurulum gerektirmeyen ve zamansal çözünürlük böylece bunların potansiyel uygulamalarını sınırlayıcı, hızlı fizyolojik süreçler için alt uygunudur.
Hücre içi görüntüleme gerçekleştirmek için, sonda sitozolüne plazma zarından teslim edilmesi gerekmektedir. Dendrimerler nedeniyle boyut ve hidrofiliklik için geçirgen zar değildir gibi, hücre içi dağıtım elektroporasyon yoluyla elde edilebilir. Yaygın olarak transfeksiyon için biyolojide kullanılan bu tekniğin, vasıtasıyla, işaretlenmiş makro moleküller etkili bir yüksek kaliteli görüntüleme gerçekleştirmek için hücre içine teslim edilebilir. Makromoleküller direkt olarak sitoplazmaya gönderilir Dahası, elektroporasyon ile dendrimer endositoz ile ilişkili komplikasyonlar önlenebilir. Elektroporasyon farklı dendrimerler da herhangi bir hedef dizinin yokluğunda hücre içinde ayrı lokalizasyonu gösterir İlginç sonra. 5. Bu pasife nedeniyle sadece dendrimere fizikokimyasal özellikleri, hedef organel-spesifik pH görüntüleme elde etmek için istismar edilebilir.
Oranlı metrik görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kovalent olarak dendritik iskele konjüge floresan ve rodamin, ayrı ayrı görüntülendi ve bir piksel-piksel oranı harita oluşturuldu. Ionofor vasıtasıyla canlı hücrelerde hücre içi pH değerini kontrol etmek için çeşitli prosedürler bildirilmiştir. İyonoforlar plazma zarından iyonları taşıma mümkün küçük hidrofobik moleküller olan, H + iyonu için iyonoforlar, örneğin nigerisin gibi, kullanılabilir ve dendrimer bazlı sensörler kalibre etmek için kullanılabilen 16 Bu ölçümler görülmektedir ne benzer pH'ye doğrusal bir tepki tespit edildi. in vitro. Kalibrasyon hücre içi pH'ın temelinde doğru olarak ölçülebilir. Bu ölçümler dendrimer-tabanlı sensör çalışma H + Homeost değerli bir araç olabilir göstermiştirasis canlı hücreler ve patolojik süreçlerde pH düzenleme arızaları içerdiğini.
Son zamanlarda dendrimer bazlı pH sensörler de anestezi uygulanmış farelerin beyninde pH görüntüleme yapmak, in vivo olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. 17 nedeniyle in vivo algılamada yüksek kaliteli bir teknik olarak zor olduğu canlı dokuların karmaşık çevreye. Burada beyinde doğru bir pH görüntüleme gerçekleştirmek için ele alınması gereken önemli konulardan vurgu ile in vivo pH görüntüleme için deneysel işlemin ayrıntılı bir açıklamasını gösterir. İki-foton mikroskopi iki ana nedenden dolayı istihdam edilmiştir: i) kızılötesi ışık kullanımı standart konfokal mikroskopi doku penetrasyon eksikliği aşmak için izin verir; ii) floresein ve rodaminin geniş iki-foton soğurma onların eşzamanlı uyarma kaçınarak izin uyarım dalga boyu için iki kullanımına ilişkin komplikasyonlar. fare beyninde pH ölçümleri edildibaşarıyla yürütülen, sensörler kolayca beyin hücre dışı boşlukta pH değişimine neden hipoksi yanıt. Bu ölçümler, dendrimer tabanlı göstergeleri başarılı bir hayvan modelinde in vivo olarak pH fizyolojik ve patolojik değişiklik vurgulamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrimer bazlı sensörler ile başarılı bir pH görüntüleme için kritik adımlar şunlardır: i) doğru dendritik skafoldun seçimi ve buna konjüge edilmiş göstergelerin sayısı ve hücrelerinde ya da in vivo olarak teslim sensor protokol ii) optimizasyonu.
Sentetik prosedür oldukça kolay olan ve her amin taşıyan aşırı dallı polimer hemen hemen uygulanabilir. Sensörler, tek bir aşamada ticari olarak temin edilebilir, dendrimerler ve NHS-aktif boyalar el…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Isja de Feijter ve Matt Baker ile yararlı görüşmeler müteĢekkiriz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
Riferimenti
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
- Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
- Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
- Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
- Caminade, A. -. M., Turrin, C. -. O., Majoral, J. -. P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
- Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
- Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
- Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
- Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
- Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
- Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
- Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
- Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
- Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
- Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
- Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
- Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
- . . Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
