Synthese, Cellular Levering en<em> In vivo</em> Toepassing van Dendrimeer-gebaseerde pH Sensoren

Summary

Fluorescentie sensoren zijn krachtige hulpmiddelen in life science. Hier beschrijven we een methode te synthetiseren en te gebruiken dendrimeer gebaseerde fluorescente sensoren pH meten in levende cellen en in vivo. De dendritische steiger versterkt de eigenschappen van geconjugeerde fluorescente kleurstoffen leidt tot betere detectie eigenschappen.

Abstract

De ontwikkeling van fluorescerende indicatoren betekende een revolutie voor de life sciences. Genetisch gecodeerde en synthetische fluoroforen met sensing capaciteiten kon de visualisatie van biologisch relevante soorten met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Synthetische kleurstoffen zijn van bijzonder belang zijn dankzij hun hoge tunability en het brede scala van meetbare analyten. Echter, deze moleculen lijden een aantal beperkingen met betrekking tot kleine molecule gedrag (slechte oplosbaarheid, moeilijkheden bij targeting, vaak geen ratiometrisch imaging toegestaan). In dit werk introduceren we de ontwikkeling van dendrimeer gebaseerde sensoren zijn en een procedure voor pH-meting in vitro, in levende cellen en in vivo. We kiezen dendrimeren als ideaal platform om onze sensoren voor hun vele gewenste eigenschappen (monodispersiteit, instelbare eigenschappen, multivalentie) dat ze een veel gebruikte steiger voor meerdere biomedische apparaten gemaakt. De vervoeging van fluorescerende pHindicatoren om de dendrimer schavot geleid tot een verbetering van hun sensing optredens. In het bijzonder dendrimeren vertonen verminderde cel lekkage, verbeterde intracellulaire targeting en laat ratiometrisch metingen. Deze nieuwe sensoren werden met succes toegepast om de pH te meten in levende HeLa cellen en in vivo in muizenhersenen.

Introduction

Het gebruik van fluorescerende moleculen aan specifieke biologisch relevante moleculen te labelen is volledig veranderd de manier waarop we bestuderen van biologische systemen. Widefield en confocale microscopie toegestaan ​​voor een real-time hoge-resolutie visualisatie van biologische processen en tegenwoordig de meest populaire technieken studeren biologische gebeurtenissen in vitro in cellen en in vivo. ^1A relevante verbetering werd voorgesteld door de ontwikkeling van fluorescentie indicatoren , dwz kleurstoffen waarvan de fluorescentie afhankelijk is van de concentratie van een specifieke moleculaire entiteit. pH en calcium indicatoren bijzonder had een dramatisch effect op de studie van de celfysiologie door de enorme relevantie van H ⁺ en ^{Ca2 +-ionen} in de biologie. ^2,3

De meeste van de detectie kleurstoffen vertonen vele intrinsieke beperkingen in hun kleine moleculen gedrag, zoals: i) moeilijkheden subcellulaire targeting, ii) een slechte oplosbaarheid in water en daardoor slechte biocompatibiliteit,. en iii) cel lekkage en dus weinig tijd-lapse imaging vermogen ⁴ Bovendien is het signaal van vele probes kunnen niet worden gecorrigeerd voor de afhankelijkheid van de kleurstof concentratie (non- ratiometrische beeldvorming) en derhalve een absolute meting in cellen of in vivo niet mogelijk.

We hebben recent beschreven een eenvoudige en effectieve methode om deze beperkingen op basis van de conjugatie van sensing kleurstoffen op een dendrimeer steiger. ⁵ Dendrimeren zijn monodisperse hypervertakte polymeren met zeer aantrekkelijke eigenschappen voor biologische toepassingen. ⁶ name dendritische verscheidene platforms ontwikkeld en gebruikt voor drug ⁷ en gen delivery. ⁸ Zeer recent verscheidene trad vanaf het potentieel van deze moleculen als matrix voor sensoren onderzoeken. ^9,10,11

We hebben eerderbeschreven een eenvoudige synthetische route naar de functionalisering van verschillende polyamidoamine (PAMAM) scaffolds gebaseerd op NHS-geactiveerde esters. ¹² Conjugaten kunnen in een enkele stap worden verkregen door middel van dialyse zoals het zuiveren. Interessant deze benadering kan eenvoudig worden toegepast op een verscheidenheid van dendritische of polymere scaffolds. ^13,14

Om ratiometrisch beeldvorming dendrimeren bereiken waren dubbel-gelabeld met twee sets van kleurstoffen: i) een pH-indicator (dwz fluoresceïne) en ii) een pH-onafhankelijke fluorescerende groep (dwz rhodamine). Dit liet ons toe om nauwkeurige pH beeldvorming uitgevoerd als de verhouding tussen fluoresceïne en rhodamine alleen afhankelijk van de pH en niet meer van de concentratie van de probe. Een andere interessante benadering van dit probleem wordt vertegenwoordigd door het gebruik van levensduur probes. ¹⁵ Aangezien de levensduur niet afhankelijk probeconcentratie deze metingen geen ratiometrische correctie nodig. Echter, lifetime metingen vereisen een meer gecompliceerde instrumentale setup en hun temporele resolutie is suboptimaal voor snelle fysiologische processen, waardoor de beperking van hun potentiële toepassingen.

Om intracellulaire beeldvorming uitvoeren, moet de sonde over het plasmamembraan te leveren in het cytosol. Aangezien de dendrimeren niet doorlaatbaar membraan vanwege hun grootte en hydrofiliciteit kan intracellulaire afgifte worden bereikt door elektroporatie. Met deze techniek op grote schaal gebruikt in de biologie voor transfectie, gelabelde macromoleculen kunnen effectief in cellen afgeleverd hoge beeldkwaliteit voeren. Bovendien, met elektroporatie complicaties gerelateerd aan dendrimeer endocytose kunnen worden vermeden als de macromoleculen rechtstreeks geleverd aan het cytoplasma. Interessant na elektroporatie verschillende dendrimeren toont verschillende lokalisaties in de cellen zelfs bij gebreke van een specifieke targeting-sequentie. ⁵ Deze passievee gericht, alleen vanwege de fysisch-chemische eigenschappen van het dendrimeer, kan worden benut om organel-specifieke pH beeldvorming bereiken.

Ratiometrische beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie. Fluoresceïne en rhodamine, covalent geconjugeerd met de dendritische schavot werden afzonderlijk afgebeeld en een pixel-voor-pixel verhouding map is gemaakt. Verschillende procedures intracellulaire pH controle in levende cellen door middel van ionoforen gemeld. Ionoforen zijn kleine hydrofobe moleculen voor ionen over het plasmamembraan vervoer; ionoforen voor H ⁺ ion, zoals nigericine, zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt om dendrimeer gebaseerde sensoren kalibreren ¹⁶ Deze metingen toonden een lineaire respons op pH overeenkomstig hetgeen waargenomen. in vitro. Op basis van de kalibratie intracellulaire pH nauwkeurig kan worden gemeten. Deze metingen toonden aan dat dendrimer gebaseerde sensor een waardevol instrument in studie H ⁺ homeost kan zijnasis in levende cellen en pathologische processen die pH-regulering storingen betrekken.

We hebben onlangs aangetoond dat dendrimeer gebaseerde pH sensoren ook kan worden toegepast in vivo uitvoeren pH beeldvorming in de hersenen van verdoofde muizen. ¹⁷ Wegens de complexe omgeving van levende weefsels hoge kwaliteit in vivo detectie is technisch uitdagend. Hier laten we een gedetailleerde beschrijving van de experimentele procedure voor in vivo pH beeldvorming met nadruk van de cruciale kwesties die moeten worden aangepakt om een nauwkeurige pH beeldvorming te voeren in de hersenen. Twee-foton microscopie werd toegepast om twee belangrijke redenen: i) het gebruik van infrarood licht kan het ontbreken van weefselpenetratie standaard confocale microscopie overwinnen, ii) de algemene twee-foton absorptie van fluoresceïne en rhodamine toestaan ​​hun gelijktijdige excitatie vermijden van de complicaties met betrekking tot het gebruik van twee golflengten voor excitatie. pH-metingen in de hersenen van muizen warenmet succes uitgevoerd; sensoren gemakkelijk reageren op hypoxie veroorzaken verandering van de pH in de hersenen extracellulaire ruimte. Deze metingen tonen aan dat dendrimeer gebaseerde indicatoren met succes kunnen worden gebruikt om fysiologische en pathologische verandering van de pH in vivo in een diermodel markeren.

Protocol

1. Synthese van de sensoren In de volgende paragraaf geven we een procedure voor de vervoeging van pH indicatoren PAMAM dendrimeren. Hetzelfde protocol kan worden toegepast met minimale modificatie alternatieve amine-dragende dendrimeren. 5,17,13,14 handel verkrijgbare dendrimeren en pigmenten kunnen zonder verdere zuivering worden gebruikt. Los het dendrimeer in watervrij DMSO (50 uM eindconcentratie). Bereid 10 mM voorraad oplossingen van fluoresceïne-NHS en tetramethyl-rhodamine-NHS (…

Representative Results

Figuur 1 toont een schematische weergave van de vervoeging van sensing kleurstoffen aan verschillende dendritische steigers. De resulterende indicatoren kan worden verkregen in een eenvoudige synthetische stap uit in de handel verkrijgbare producten. Amine-dragende dendrimeren reageren met NHS-geactiveerde kleurstoffen in DMSO en gezuiverd door dialyse. Deze algemene procedure is al met succes gebruikt voor het labelen van verschillende dendrimeren: i) PAMAM dendrimeer generatie 2, 4 en 6; 12…

Discussion

De kritische stappen voor een succesvolle pH beeldvorming met dendrimeer gebaseerde sensoren zijn: i) het selecteren van de juiste dendritische steiger en het aantal indicatoren geconjugeerd aan het en ii) het optimaliseren van de sensor productietijd protocol in cellen of in vivo.

Het synthetische proces is redelijk eenvoudig en kan praktisch worden toegepast op elk amine dragende hypervertakte polymeer. De sensoren kunnen worden verkregen uit commercieel verkrijgbare dendrimeren e…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500