Synthesis, Cellular Levering og<em> In vivo</em> Anvendelse af Dendrimer-baserede pH-sensorer

Summary

Fluorescens sensorer er stærke værktøjer i life science. Her beskriver vi en metode til at syntetisere og anvende dendrimer-baserede fluorescerende sensorer til at måle pH i levende celler og in vivo. Dendritiske stillads forbedrer egenskaberne af konjugerede fluorescerende farvestoffer, der fører til forbedrede sensing egenskaber.

Abstract

Udviklingen af ​​fluorescerende indikatorer repræsenterede en revolution for biovidenskab. Genetisk kodede og syntetiske fluorophores med sensing evner tillod visualisering af biologisk relevante arter med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Syntetiske farvestoffer er af særlig interesse på grund af deres høje justerbarhed og den brede vifte af målbare analytter. Men disse molekyler lider flere begrænsninger relateret til lille molekyle adfærd (dårlig opløselighed, vanskeligheder med målretning, ofte ingen ratiometrisk billeddannelse tilladt). I dette arbejde har vi indføre udvikling af dendrimer-baserede sensorer og præsentere en procedure for pH-måling in vitro, i levende celler og in vivo. Vi vælger dendrimers som ideel platform for vores sensorer for deres mange ønskelige egenskaber (monodispersity, justerbare egenskaber, multivalens), der gjorde dem til et udbredt stillads flere biomedicinsk udstyr. Bøjningen af ​​fluorescerende pHindikatorer til dendrimer skafottet førte til en styrkelse af deres sensing forestillinger. Især dendrimerer udviser reduceret celle lækage, forbedret intracellulær målretning og tillade ratiometrisk målinger. Disse nye sensorer blev anvendt med succes til at måle pH i levende HeLa-celler og in vivo i muse-hjerne.

Introduction

Brugen af ​​fluorescerende molekyler til at mærke specifikke biologisk relevante molekyler har fuldstændig ændret den måde, vi studerer biologiske systemer. Widefield og konfokal mikroskopi tilladt for en real-time høj opløsning visualisering af biologiske processer, og i dag er blandt de mest populære teknikker til at studere biologiske begivenheder in vitro, i celler og in vivo. ^1. En relevant forbedring var repræsenteret ved udviklingen af fluorescens indikatorer , dvs farvestoffer, hvis fluorescens er afhængig af koncentrationen af en specifik molekylær enhed. pH-og calcium indikatorer især haft en dramatisk indvirkning på studiet af cellens fysiologi grund af den enorme betydning af H ⁺ og Ca ^{2 +-ioner} i biologi. ^2,3

Men de fleste af de sensing farvestoffer tilstedeværende række iboende begrænsninger relateret til deres lille molekyle adfærd såsom: i) vanskeligheder subcellulære targeting ii) dårlig opløselighed i vand og dermed dårlig biokompatibilitet. og iii) celle lækage og dermed mangel på lang time-lapse imaging evne ^4. Desuden signal af mange sonder kan ikke korrigeres for afhængigheden af farvestofkoncentrationen (non- ratiometrisk billeddannelse), og derfor en absolut måling i celler eller in vivo er ikke mulig.

Vi har for nylig beskrevet en enkel og effektiv metode til at overvinde disse begrænsninger, er baseret på konjugation af sensing farvestoffer på en dendrimer stillads. ⁵ Dendrimers er monodisperse hyperforgrenede polymerer med meget tiltalende egenskaber til biologiske anvendelser. ^6. Især flere dendritiske arkitekturer er blevet udviklet og anvendt for ^stof-7 og gen levering. ^8. Først for ganske nylig flere grupper begyndte at udforske potentialet i disse molekyler som stillads for følere. ^9,10,11

Vi har tidligerebeskrevet en let syntesevej mod funktionalisering af forskellige polyamidoamin (PAMAM) stilladser baseret på NHS-aktiverede estere. ¹² Konjugater kan opnås i et enkelt trin ved hjælp af dialyse som kun oprensning. Interessant denne fremgangsmåde let kan anvendes til en række af dendritiske eller polymere stillads. ^13,14

For at opnå ratiometrisk billeddannelse dendrimerer var dobbelt-mærket med to sæt af farvestoffer: i) en pH-indikator (dvs. fluorescein) og ii) en pH-uafhængig fluorescerende del (dvs. rhodamin). Dette tillod os at udføre nøjagtige pH billeddannelse som forholdet mellem fluorescein og rhodamin er kun afhængig af pH og ikke mere på koncentrationen af ​​sonden. En anden interessant tilgang til dette spørgsmål er repræsenteret ved brug af livstids-baserede prober. ¹⁵ Som levetid ikke afhænger probekoncentration disse målinger behøver ikke en ratiometriske korrektion. Men lifEtime målinger kræver en mere kompliceret instrumental opsætning og deres tidsmæssige opløsning er sub-optimale til hurtige fysiologiske processer, hvilket begrænser deres potentielle anvendelsesmuligheder.

For at udføre intracellulær billeddannelse, skal leveres over plasmamembranen i cytosolen sonden. Da dendrimerer ikke membran permeable på grund af deres størrelse og hydrofilicitet, kan intracellulær levering opnås ved elektroporation. Ved hjælp af denne teknik, er meget udbredt i biologi til transfektion kan mærkede makromolekyler effektivt afgives til celler til at udføre høj billedkvalitet. Desuden med elektroporation af komplikationer relateret til dendrimer endocytose kan undgås som makromolekyler leveres direkte til cytoplasmaet. Interessant efter elektroporation forskellige dendrimerer viser distinkte lokaliseringer inde i cellerne, selv i mangel af en specifik sekvens målretning. ⁵ Denne passive målretning, kun på grund af de fysisk-kemiske egenskaber af dendrimeren, kan udnyttes til at opnå organel-specifik pH-billeddannelse.

Ratiometrisk billeddannelse kan udføres ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Fluorescein og rhodamin, konjugeres kovalent til dendritiske stilladset blev separat afbildet og pixel-for-pixel-forhold kort blev oprettet. Adskillige procedurer til kontrol af intracellulær pH ​​i levende celler ved hjælp af ionophorer blev rapporteret. Ionoforer er små hydrofobe molekyler stand til at transportere ioner over plasmamembranen, ionoforer for H ^+-ion, såsom nigericin, er tilgængelige og kan anvendes til at kalibrere dendrimer-baserede sensorer ¹⁶ Disse målinger viste en lineær respons til pH på samme måde, hvad overholdes. in vitro. På grundlag af kalibreringen intracellulære pH kan måles nøjagtigt. Disse målinger viste, at dendrimer-baserede sensor kan være et værdifuldt redskab i studiet H ⁺ homeostAsis i levende celler og patologiske processer, der involverer pH-regulering funktionsfejl.

Vi har for nylig påvist, at dendrimer-baserede pH-sensorer kan også anvendes in vivo, der udfører pH billeddannelse i hjernen på bedøvede mus. ^17. På grund af det komplekse miljø af levende væv en høj kvalitet i vivo sensing er teknisk udfordrende. Her viser vi en detaljeret beskrivelse af den eksperimentelle procedure for in vivo pH billeddannelse med vægt af de afgørende spørgsmål, der skal behandles for at udføre en nøjagtig pH-billeddannelse i hjernen. To-foton mikroskopi har været ansat i to hovedårsager: i) anvendelse af infrarødt lys tillader at afhjælpe manglen på vævspenetration standard konfokal mikroskopi, ii) den brede to-foton absorption af fluorescein og rhodamin tillade deres samtidige excitation undgå komplikationer relateret til anvendelsen af ​​to bølgelængder til excitation. pH målinger i musehjerne blevsucces gennemført, sensorer let reagere på hypoxi fremkalde ændring af pH i hjernen ekstracellulære rum. Disse målinger viser, at dendrimer-baserede indikatorer, med held kan anvendes til at fremhæve fysiologisk og patologisk ændring af pH i vivo i en dyremodel.

Protocol

1.. Syntese af sensorerne I det følgende afsnit giver vi en procedure for konjugation af pH-indikatorer til PAMAM dendrimerer. Den samme protokol kan anvendes med minimal modifikation til alternative amin-bærende dendrimerer. 5,17,13,14 Kommercielt tilgængelige dendrimers og farvestoffer kan anvendes uden yderligere oprensninger. Dendrimeren opløses i vandfrit DMSO (50 uM slutkoncentration). Forbered 10 mM stamopløsninger af fluorescein-NHS og tetramethyl-rhodamin-NHS (TMR) i vandfri…

Representative Results

Figur 1 viser en skematisk repræsentation af konjugation af sensing farvestoffer til forskellige dendritiske stillads. Kan opnås de resulterende indikatorer i en let syntetisk skridt fra kommercielt tilgængelige produkter. Amin-bærende dendrimerer omsættes med NHS-aktiverede farvestoffer i DMSO og oprenset ved dialyse. Denne generelle procedure er allerede med held blevet anvendt til mærkning af flere dendrimerer: i) PAMAM dendrimer generation 2, 4 og 6, 12 pegylerede PAMAM dendrimerer …

Discussion

De kritiske skridt for en vellykket pH billeddannelse med dendrimer-baserede sensorer er: i) udvælgelsen af den korrekte dendritiske stillads, og antallet af indikatorer, konjugeret til det og ii) optimering af sensor levering protokol i celler eller in vivo.

Den syntetiske fremgangsmåde er forholdsvis let og kan anvendes til næsten alle amin-bærende hyperbranched polymer. Sensorerne kan fås fra kommercielt tilgængelige dendrimers og NHS-aktiverede farvestoffer i et enkelt tri…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500