फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी
Summary
Intravital माइक्रोस्कोपी जीवित पशुओं में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं इमेजिंग सक्षम बनाता है एक शक्तिशाली उपकरण है. इस लेख में हम रहते हैं, चूहों की लार ग्रंथियों में ऐसी स्रावी granules जैसे subcellular संरचनाओं,, की गतिशीलता इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
यहाँ हम confocal intravital माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर आधारित है कि लाइव कृन्तकों में छवि subcellular संरचनाओं के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. वे कई लाभ प्रदान के बाद से एक मॉडल के अंग के रूप में हम रहते हैं, चूहों की लार ग्रंथियों का उपयोग करें. पहला, वे आसानी से प्रकाशिकी के लिए पहुँच सक्षम उजागर करने के लिए, और दिल की धड़कन और श्वसन के कारण गति कलाकृतियों की कमी की सुविधा के लिए स्थिर किया जा सकता है. यह काफी इमेजिंग और छोटे subcellular संरचनाओं पर नज़र रखने की सुविधा. दूसरा, लार ग्रंथियों की सेल आबादी के सबसे अंग की सतह से सुलभ हैं. इस तरह के दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में vivo इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है कि अन्य तकनीकों की तुलना में एक उच्च स्थानिक संकल्प किया है कि confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग की अनुमति. अंत में, लार ग्रंथियों को आसानी से इस प्रकार एक आण्विक स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक मजबूत प्रणाली उपलब्ध कराने, औषधीय और आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है.
इस अध्ययन में हम कोष्ठकी कोशिकाओं में स्रावी granules के एक्सोसाइटोसिस और स्रावी granules बीटा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की उत्तेजना पर फ्यूज जहां शिखर प्लाज्मा झिल्ली की गतिशीलता के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए बनाया गया एक प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित. विशेष रूप से, हम साइटोसोलिक GFP और फ्लोरोसेंट प्रोटीन मिलकर-टमाटर के साथ जुड़े हुए एक झिल्ली लक्षित पेप्टाइड सह व्यक्त करता है कि एक ट्रांसजेनिक माउस का इस्तेमाल किया. हालांकि, हम लार ग्रंथियों को स्थिर करने और छवि के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं है कि अन्य माउस मॉडल के लिए बढ़ा दिया है और इस तरह endosomes, लाइसोसोम, mitochondria के रूप में विभिन्न subcellular संरचनाओं, के दृश्य को सक्षम करने, vivo सेलुलर घटकों लेबल करने के लिए अन्य तरीकों के लिए युग्मित, और किया जा सकता है actin cytoskeleton.
Introduction
पिछले दो दशकों में रहते माइक्रोस्कोपी के आगमन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग इस प्रकार कोशिका जीव विज्ञान 1 के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने, हर कल्पना सेलुलर प्रक्रिया पर बड़ी सफलताओं के लिए नेतृत्व किया. इस क्षेत्र में यह प्रायोगिक जोड़तोड़ की बात आती है, खासकर जब अत्यंत शक्तिशाली मॉडल प्रणाली, कर रहे हैं कि स्तनधारी सेल संस्कृतियों के उपयोग से काफी लाभ हुआ है. हालांकि, वे अक्सर जटिल बहुकोशिकीय जीव 2 के जीव विज्ञान का सही प्रतिनिधित्व नहीं प्रदान करते हैं. यह समस्या ऐसे तंत्रिका जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी और ट्यूमर जीव विज्ञान के रूप में 3 क्षेत्रों में महत्वपूर्ण जैविक सवालों की जांच करने के लिए दरवाजा खोल दिया है कि intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) के विकास के द्वारा संबोधित किया जाना शुरू हो गया है. अब तक, IVM पर आधारित अध्ययन के अधिकांश subcellular डिब्बों की गतिशीलता के बारे में कोई जानकारी उपलब्ध कराने के बिना, ऊतकों और व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर प्रदर्शन किया गया है. हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला और अन्यरहते कृन्तकों 4-7, 13-15 और इन विवो में औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ की अनुमति में इमेजिंग subcellular संरचनाओं में सक्षम IVM तकनीक विकसित की है. यह दृष्टिकोण विवो में झिल्ली तस्करी का अध्ययन करने के लिए हमारे द्वारा इस्तेमाल किया, और अधिक विशेष रूप से endocytosis और एक्सोसाइटोसिस 6,7 विनियमित किया गया है.
हमारे प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली, उजागर स्थिर और anesthetized कृन्तकों के अवअधोहनुज लार ग्रंथियों (एसजीएस) इमेजिंग पर आधारित है. IVM के लिए एक मॉडल के अंग के रूप में एसजीएस के चुनाव ग्रंथियों एक मामूली सर्जरी प्रदर्शन से आसानी से सुलभ हैं कि इस तथ्य के कारण है, उनके शरीर क्रिया विज्ञान से समझौता किए बिना externalized, और दिल की धड़कन और श्वसन की वजह से गति कलाकृतियों को कम करने के लिए स्थिर हो सकता है. इसके अलावा, एसजीएस चुनिंदा लार वाहिनी 8,9 के माध्यम से वायरल या गैर वायरल या तो आधारित वैक्टर इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है. अंत में, एसजीएस ध्रुवीकृत epith से बना बहि: स्त्रावी हैंacini और नलिकाओं, myoepithelial कोशिकाओं, और stromal कोशिकाओं की एक जटिल जनसंख्या जो फार्म elial कोशिकाओं,. इस कारण से, वे हमारे हाल के अध्ययनों से 10 में डाला, एक्सोसाइटोसिस, endocytosis, जीन वितरण, और actin cytoskeleton का अध्ययन, और इस तरह के सेल polarity, कोशिका विभाजन, सेल के रूप में कोशिका जीव विज्ञान के पहलुओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करने के लिए एक शानदार मॉडल हैं सेल जंक्शनों, और आयन चैनल.
इस पत्र में हम विस्तार में एक जीवित माउस के एसजीएस की उपकला में subcellular संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन. विशेष रूप से, हम कैसे विनियमित एक्सोसाइटोसिस दौरान एसजीएस के कोष्ठकी कोशिकाओं में छवि स्रावी granules को दिखाते हैं. पहले से दिखाया गया है, बीटा एड्रीनर्जिक रिसेप्टर की agonists के साथ उत्तेजना पर, स्रावी granules शिखर प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और धीरे – धीरे पतन, कोष्ठकी canaliculi 6 में उनकी सामग्री जारी है. हमारा लक्ष्य मीटर के साथ जांचकर्ताओं के लिए बुनियादी उपकरण प्रदान करने के लिए हैसर्जिकल प्रक्रियाओं और जानवर से निपटने में inimal अनुभव, वे सफलतापूर्वक एक subcellular संकल्प पर IVM प्रदर्शन कर सकते हैं. IVM में सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा जानवर की तैयारी है, यहां हम उनके कार्य समझौता किए बिना एसजीएस बेनकाब और स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है कि बुनियादी सर्जिकल प्रक्रियाओं के वर्णन पर ध्यान केंद्रित. ऐसे प्रणालीगत फ्लोरोसेंट जांच का वितरण, ट्रांसजेनिक जानवरों के उपयोग, या दोनों के संयोजन के रूप subcellular संरचनाओं, कई रणनीतियों, लेबल करने के लिए प्रक्रियाओं के रूप में, कहीं 7,11 वर्णित किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
अब तक subcellular संरचनाओं ज्यादातर इन विट्रो (यानी सेल संस्कृतियों) में या अक्सर बरकरार रहते ऊतकों 6 की विशेषताओं पुनरावृत्ति नहीं है कि पूर्व vivo (यानी अंग संस्कृतियों, ऊतक स्लाइस, कोष्ठकी तैयारी) म?…
Acknowledgements
इस शोध एनआईएच के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम, दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
Riferimenti
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