Renal Cápsula xenotrasplante y subcutánea Pellet Implantación para la Evaluación de la próstata Carcinogénesis y la hiperplasia prostática benigna
Summary
Se describe la fabricación de pellets de la hormona del comprimido, así como la implantación quirúrgica subcutánea en ratones. Esta estrategia se puede combinar con el crecimiento de xenoinjertos de células y tejidos debajo de la cápsula renal de ratones desnudos atímicos para evaluar la carcinogénesis y la regulación del crecimiento benigno de la próstata hormonal.
Abstract
Nuevas terapias para dos enfermedades comunes de la próstata, cáncer de próstata (AEP) y la hiperplasia prostática benigna (HPB), dependen fundamentalmente de experimentos que evaluaban su regulación hormonal. Hormonas sexuales esteroideas (especialmente los andrógenos y estrógenos) son importantes en la PRCA y BPH; sondeamos sus respectivas funciones en la inducción de crecimiento de la próstata y la carcinogénesis en ratones con experimentos utilizando bolitas de hormonas comprimidos. Gránulos hormonales y / o de drogas se fabrican fácilmente con una prensa de pellets, y implantado quirúrgicamente en el tejido subcutáneo del huésped ratón macho. También se describe un protocolo para la evaluación de la carcinogénesis hormonal mediante la combinación subcutánea implantación de los microgránulos de la hormona con xenoinjertos de recombinantes celulares de próstata bajo la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos. Por otra parte, la implantación de pellets hormona subcutánea, en combinación con la cápsula renal de los xenoinjertos de tejido de BPH, es útil para comprender mejor la regulación hormonal de Prost benignacomió el crecimiento, y para probar nuevas terapias dirigidas a los esteroides sexuales vías hormonales.
Introduction
El cáncer de próstata (AEP) y la hiperplasia prostática benigna (BPH) son una carga para la salud. La AEP es el segundo cáncer de órgano sólido más frecuente en hombres y una causa principal de muerte por cáncer relacionadas 1. HPB también tiene una alta prevalencia entre los hombres de mayor edad, y se estima que la manifestación clínica de la HBP, síntomas del tracto urinario inferior (STUI), afectará el 50-90% de los hombres 2. Mientras que los andrógenos y los estrógenos son conocidos por ser importante en PRCA y la BPH, nuestra comprensión de los mecanismos hormonales que subyacen en la carcinogénesis y el crecimiento sigue siendo incompleta 3,4. Modelos animales simples y manejables genéticamente sustentan los estudios que aborden estas prioridades en la investigación de la próstata. En hormonales enfermedades sensibles, tales como una AEP y BPH, el uso de la vía subcutánea, los pellets de hormonas de liberación lenta, de manera aislada o en combinación con la cápsula renal xenoinjertos (la transferencia de células, tejidos u órganos de una especie en otra) en el immunocompanfitrión ratón romised, proporciona un método sencillo y reproducible para el estudio de la regulación hormonal de crecimiento y la carcinogénesis.
La implantación subcutánea de pellets hormona es una técnica sencilla y reproducible para estudiar la regulación hormonal de la carcinogénesis y el crecimiento benigno en la próstata 5. La implantación subcutánea de ratones macho adultos con 25 mg de testosterona (T) y 2,5 mg de 17β-estradiol (E 2), provoca un aumento en el suero E 2 y la disminución gradual en T, recrear el ambiente hormonal dinámica de hombres de edad avanzada 5,6. Además, este modelo recapitula muchas de las características clínicas de la HBP-STUI 5,7. Los métodos alternativos de administración de hormonas incluyen la administración oral / sonda o inyección intraperitoneal, que causar angustia al roedor, son menos consistentes en la entrega de la misma cantidad de fármaco en el tiempo, y son más mano de obra que una implantación quirúrgica de una sola vez. Otros modos de subcutáneos para Hormone y / o la administración de fármacos incluyen cápsulas de Silastic 8. Mientras que también tenemos experiencia con el uso de cápsulas de Silastic, gránulos comprimidos son favorecidos por su facilidad de uso y reproducibilidad. Por otra parte, las tasas de liberación de gránulos hormonales comprimidas mejor imitan los ratios de hormonas sexuales esteroideas dinámicas observadas en hombres de edad 5,7.
Desde el desarrollo de los ratones genéticamente inmunocomprometidos, numerosos sistemas de modelos in vivo en xenoinjertos que incorporan técnicas se han desarrollado para el estudio de una amplia variedad de tejidos normales y enfermos. Hay varias categorías básicas de los xenoinjertos. Xenoinjertos tisulares consisten en un pequeño trozo de tejido intacto, lo que puede ser una estructura normal, tumoral maligna o crecimiento benigno. Szot et al. (2007) han iluminado recientemente renal cápsula xenoinjertos de islotes pancreáticos 9. Aamdal et al. (1985) describió renal cápsula xenoinjertos de 27 líneas celulares de cáncer humano en imratón munocompromised alberga 10. Los injertos también pueden estar compuestos de una sola línea celular inmortalizada (canceroso o no tumorigénicos), o pueden consistir en una línea celular inmortalizada en combinación con células aisladas a partir de mesénquima (injerto recombinante de células).
Estamos a favor de los xenoinjertos de recombinantes de células para investigar las funciones respectivas del estroma y el epitelio en el desarrollo de una AEP y BPH. Cunha et al. (1980) fue el primero en informar de que cuando adultos murino epitelio de la vejiga se combina con mesénquima embrionario urogenital sinusal (UGM) y xenoinjertado bajo la cápsula renal de ratones machos anfitriones, el tejido se desarrolla en las estructuras que se asemejan acinos prostáticos 11. Norman et al. (1986) mostró que el ratón adulto prostática epitelio ductal y UGM, cuando se combinan en los recombinantes de tejido, se someten a un crecimiento ductal y la morfogénesis de ramificación 12. Hayward et al. (1988) mostró que el epitelio de próstata humano responde a inductivo m fetalesenchyme de una manera similar 13. Un modelo de carcinogénesis hormonal en la próstata, mediante la combinación de la inmortalizada de próstata humana línea celular epitelial de la HBP-1 con UGM, se informó por primera vez por Wang et al. 14 (2001) y se ha utilizado ampliamente en nuestro laboratorio 15. Este modelo es muy adecuado para la comprensión de APCR progresión porque epitelio prostático benigno se transforma en enfermedad metastásica, el modelado avanzado APCR en humanos 5. Dado que los componentes específicos pueden ser manipuladas genéticamente, el injerto celular recombinante es particularmente útil como un enfoque para evaluar las interacciones estroma epitelial.
Otros sitios adecuados para los xenoinjertos son intradérmica, subcutánea y lugares ortotópico 16. Dependiendo del proceso de tejido y la enfermedad de interés, estos pueden ser los enfoques alternativos adecuados. Para el estudio de la carcinogénesis hormonal de la próstata y la regulación del crecimiento benigno, elegimos la cápsula renalEl sitio de xenoinjerto debido a sus injerto más altos tasa de absorción, abundante suministro de sangre, y la capacidad de implantar un mayor número de xenoinjertos en un sitio confinado 16. Por otra parte, la manipulación hormonal de ratón huésped que resulta en la atrofia prostática limita el uso de injerto de próstata ortotópico 16.
Este protocolo describe las técnicas de fabricación de la hormona comprimido / gránulo de drogas y la implantación quirúrgica, así como la cápsula renal de los xenoinjertos de injertos de células de próstata humana y tejidos. En conjunto, estas técnicas proporcionan un ensayo sensible para determinar si un ratón modificado genéticamente es más susceptible a PRCA y / o iniciación HPB que las cepas de control. Xenotrasplante es una técnica poderosa para la evaluación in vivo de la potencial de las células experimentales para desarrollar histológico y características moleculares de malignidad, así como un ensayo para nuevas estrategias de tratamiento para una amplia variedad de enfermedades benignas y malignas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este papel y el protocolo descrito en el presente documento describen la fabricación de la hormona del comprimido y / o gránulos de drogas, y el procedimiento quirúrgico para la implantación de los microgránulos subcutánea de ratones. Dependiendo de la pregunta de investigación a tratar, esta técnica se puede realizar por separado, o en combinación con la cápsula renal de los xenoinjertos de injertos de células recombinantes de próstata o xenoinjertos de tejido de próstata, que son técnicas ampliamente uti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Ricke, pasadas y presentes. Damos las gracias a Calvin Patten, Jr., DVM y Brigitte Raabe, DVM, por sus valiosos comentarios sobre el protocolo. Nos gustaría agradecer el NIDDK, NCI, y NIEHS por su apoyo financiero para estos estudios: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN es un aprendiz en el Programa de Entrenamiento del Científico Médico de la Universidad de Rochester, financiado por el NIH T32 GM07356, el NIH bajo Ruth L. Kirschstein Nacional Research Service Award F30DK093173 también apoya este proyecto. CDV es apoyado por T32CA157322 y ABT es apoyado por T32ES007015 en la Universidad de Wisconsin-Madison. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales o NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
Riferimenti
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
