הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית

Summary

Desorption electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (דסי-MS) היא שיטה שבאמצעותו דגימות סביבה, כולל רקמות ביולוגיות, יכולות להיות צילמו עם הכנת מדגם מינימאלית. על ידי rastering המדגם מתחת לחללית היינון, טכניקה מבוססת ספריי זה מספקת רזולוציה מרחבית מספיק כדי להבחין במאפיינים מולקולריים של עניין בתוך סעיפי רקמות.

Abstract

ספקטרומטריית מסת הדמיה (MSI) מספקת מידע מולקולרי לא ממוקד עם סגוליות הגבוהה ביותר והרזולוציה מרחבית לחקירת רקמות ביולוגיות במאות עד עשרות מיקרונים קנה מידה. כאשר היא מבוצעת בתנאי הסביבה, מדגם טרום טיפול הופך להיות מיותר, ובכך לפשט את הפרוטוקול תוך השמירה על האיכות הגבוהה של מידע שהושג. יינון electrospray desorption (דסי) הוא טכניקת MSI סביבה מבוססת ספריי המאפשרת דגימה הישירה של משטחים באוויר הפתוח, גם in vivo. כאשר בשימוש עם תוכנת שלב דגימה מבוקרת, מדגם rastered מתחת לחללית יינון דסי, ודרך מישור הזמן, מידע מ '/ z הוא מתואם עם הפריסה המרחבית המינים כימיים ". נאמנותו של פלט דסי-MSI תלויה בנטיית המקור והמיצוב ביחס למדגם השטח וכניסת ספקטרומטר מסה. בזאת, אנו בודקים כיצד להכין סעיפי רקמות לדסי אניmaging ותנאי ניסוי נוספים שמשפיעים ישירות על איכות תמונה. באופן ספציפי, אנו מתארים את הפרוטוקול להדמיה של חלקי רקמות מוח חולדה על ידי דסי-MSI.

Introduction

הדמיה לא ממוקדת על ידי ספקטרומטריית מסה מאפשרת רכישת המידע כימי ליישומי גילוי והשערה מניבים. הדמיה ממוקדת של חומר כימי בשמו של עניין, ומצד שני, יכולה להקל על רגישות וסלקטיביות מוגברת באמצעות פיתוח שיטה ספציפי. ספקטרומטריית מסת הדמיה (MSI) מתבצעת לרוב על רקמות באמצעות טכניקות יינון סביבה, כוללים יינון desorption electrospray (דסי), ³ יינון אבלציה-electrospray לייזר (LAESI), ^4, MALDI, יון משנית ¹ ספקטרומטריית מסה (SIMS), ² ו ⁵ ונוזל מייקר צומת משטח דגימת בדיקה (LMJ-SSP). ⁶ בMALDI וסימס, יש דוגמאות להסרה פיזית מהדגימה, וצריכה להיות שטוחה ודק, כפי שהם ניתחו תחת ואקום גבוה. MALDI דורש ציפוי של המדגם עם ספיגת קרינת מטריצה, והוסיף נדבך נוסף ומסורבל להכנת המדגם. SIMSיש לו את הרזולוציה לרוחב הגבוהה ביותר, אך הפגזה עם חלקיקים אנרגטיים ביותר גורמת לפיצול מולקולרי נרחב. לכן, על ידי שיטות MSI הסביבה למלא נישה שבה ניתוח רך עם הכנת מדגם מינימאלית רצוי. עם זאת, נכון להיום, כל השיטות עדיין מוגבלות על ידי הדרישה של משטחי מדגם שטוחים.

דסי משתמש בספריי ממס פניאומטית בסיוע מחויב כלפי שטח המדגם לdesorb ויינן analytes. ⁷ מודל העבודה לdesorption ויינון לאחר מכן על ידי דסי שמכונה "טיפת מודל איסוף". ^8-10 הטיפין העיקריות המופקדות הופק על ידי חללית דסי מתנגש עם פני השטח, להרטיב אותו ויוצר סרט דק שלתוכו אנליטי הוא מומס על ידי מנגנון microextraction מוצק נוזל תוצאת ⁸ לאחר התנגשויות טיפה בהעברת מומנטום והמראה של טיפות משניים המכילות את החומר המופק מהמשטח . ^9,10 סופו של דבר, גזיוני שלב הם האמינו להיות מיוצרים באמצעות תהליכים כמו 'חדשות ארכיאולוגיות בעקבות אידוי יון, מודלים שאריות חיוב או דגמים אחרים, ¹¹ לעומת זאת את תהליך היווצרות יון המדויק בדסי טרם יהיה בניסוי מוכח. רגישות דסי ¹² היא מאוד תלויה במסיסות של אנליטי בתרסיס הממס, כdesorption מסתמך על microextraction המקומי. ¹³

כאשר בשימוש עם תוכנת שלב דגימה מבוקרת, המדגם נסרק unidirectionally עם נתיב קפיצה מתחת לחללית יינון דסי, ודרך מישור הזמן, מידע מ '/ z הוא מתואם עם הפריסה המרחבית המינים כימיים' (איור 1). מאז את ההוכחה הראשונה של ניסוי דסי-MSI עיקרון שדווח על ידי ואן Berkel וקרטס בשנת 2006, ¹⁴ הטכניקה התבגרה במידה ניכרת, ¹⁵ עם יישומים שדווחו בניתוח של שומנים, ^3,16 מטבוליטים סמים, ^17,18 diseaסמנים ביולוגיים SE, רקמות, רקמות מוח ^{19 3,18,20} ריאות, רקמת הכליה ^18, רקמת אשך ^{18, 18} בלוטת יותרת הכליה, ¹⁷ צלחות כרומטוגרפיה שכבה דקות, ²¹ ומשטחי אצות. ²² הרזולוציה השגרתית של תמונות שהושגו על ידי דסי-MSI הוא 100-200 מיקרומטר, אשר נקבע על ידי סופו של דבר את שטח הפנים היעיל שחולצו על ידי ספריי, אבל רזולוציות נמוכות כמו 40 מיקרומטר כבר דיווחה. החלטה כזו ^23-25 ​​והקלות של ניתוח הופכת דסי-MSI המתאים לניתוח המהיר ופשוט של דגימות רקמה ביולוגיות עם שטח פנים בטווח 0.5-5 ס"מ ^2, המאפשר הרכישה של מידע מרחבי רב ערך כדי להבין טוב יותר את התהליכים ביולוגיים ^26. כאן, כדוגמה ליישום דסי-MSI טיפוסי, אנו בודקים את הפרטים פרוצדורליים של ניהול ניסוי מוצלח הכולל הדמיה של שומנים ברקמות מוח חולדה. את שני שלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הםהכנת ²⁷ ודסי אופטימיזציה מקור יון רקמות, כפי שיתואר להלן.

Protocol

1. רקמת חתך חנות רקמות פלאש קפוא, כולו במקפיא -80 ° C עד מוכן לחתך. לאפשר דגימת הרקמה כדי להגיע לטמפרטורה בcryomicrotome לפני חתך (30 דקות). הגדר את הלהב וטמפרטורת מדגם ל-30 ° C. ?…

Representative Results

איור 3 מציג ספקטרום נציג המתקבל מסעיף מוח חולדה שלא טופל. במצב החיובי, הספקטרום ההמוני הוא נשלט על ידי phosphatidylcholines בשל היעילות גבוהה שלהם היינון (מיוחסת לקבוצת אמוניום רבעוני הטעונה חיובי). תמונת יון הכוללת של קטע הרקמה היא גם מוצגת באיור 3, מראה אות ב?…

Discussion

אופטימיזציה של הגיאומטריה מקור דסי היא קריטית עבור ניסויי MSI מוצלחים. המשתנים מרובים תורמים ליישור של מערכת משפיעים ישירות על רגישות ורזולוציה של תמונה. אם במהלך חיפוש, יש לו את הקשיים בקבלת אות הנסיין, מומלץ להשתמש בנקודת טוש אדומה מצוירת על השקופית כאמת מידה; הצבע, r…

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface