Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Summary

Dessorção de espectrometria de massa com ionização por electropulverização (DESI-MS) é um método pelo qual as amostras do ambiente, incluindo os tecidos biológicos, pode ser trabalhada com a preparação da amostra mínima. Por rastering a amostra abaixo da sonda de ionização, esta técnica baseada em pulverizador fornece resolução espacial suficiente para discernir as características moleculares de interesse dentro de cortes de tecido.

Abstract

Espectrometria de massa de imagem (MSI) fornece informações molecular segmentados com a maior especificidade e resolução espacial para a investigação de tecidos biológicos para as centenas para dezenas de escala de microns. Quando realizada sob condições ambiente, o pré-tratamento da amostra torna-se desnecessário, simplificando assim o protocolo, mantendo a elevada qualidade das informações obtidas. Dessorção de ionização por electrospray (DESI) é uma técnica baseada em MSI ambiente de pulverização, que permite a amostragem directa das superfícies, ao ar livre, mesmo in vivo. Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é rastered debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química ". A fidelidade da saída DESI MSI depende da orientação da fonte e do posicionamento em relação à superfície da amostra e uma entrada de espectrómetro de massa. Aqui, nós revisamos como preparar cortes de tecido para DESI imaging e condições experimentais adicionais que afetam diretamente a qualidade de imagem. Especificamente, nós descrevemos o protocolo para a imagem de cortes de tecidos de cérebro de rato por desi-MSI.

Introduction

Imagem não segmentados por espectrometria de massa facilita a aquisição de informações químicas para aplicações de descoberta e hipótese de geração. Imaging alvo de uma substância química conhecida de interesse, por outro lado, pode facilitar o aumento da sensibilidade e seletividade através de desenvolvimento de método específico. Espectrometria de massa de imagem (MSI) é mais comumente realizada em tecidos utilizando MALDI, ^uma espectrometria de massa de íons secundários (SIMS), ² e técnicas de ionização ambiente, incluindo dessorção ionização electrospray (DESI), ^3-ablação a laser de ionização electrospray (LAESI), ^{4, 5} e líquido micro-junção da superfície Sonda (LMJ-SSP). ⁶ Em MALDI e SIMS, as amostras têm de ser fisicamente removido do espécime, e tem que ser plana e fina, como são analisados ​​sob alto vácuo. MALDI requer revestimento da amostra com uma matriz de absorção de radiação, a adição de um passo adicional e pesado para a preparação da amostra. SIMStem a mais alta resolução lateral, mas o bombardeamento com partículas altamente energéticas provoca a fragmentação molecular grande. Portanto, a MSI por métodos ambientais preencher um nicho onde a análise macio com a preparação da amostra mínima é desejável. No entanto, até à data, todos os métodos são ainda limitada pela exigência de superfícies de amostras planas.

DESI usa um spray solvente carregada pneumaticamente assistida dirigido para a superfície da amostra para desadsorver e ioniza analitos. ⁷ O modelo de trabalho para a dessorção e ionização por subsequente DESI é conhecida como a "gota de pick-up model". ^8-10 As gotículas carregadas primárias produzido pela sonda DESI colidem com a superfície, e molhando-formação de uma película fina em que o analito é dissolvido por um mecanismo microextracção sólido-líquido ⁸ subsequente gota resultam em colisões de transferência de momento e descolagem de gotículas secundárias contendo o material extraído da superfície . ^9,10 Finalmente, o gásiões de fase são acreditados para ser produzido através de processos como a ESI-após evaporação de iões, os modelos de resíduos de carga ou de outros modelos, ¹¹ no entanto, o processo de formação de iões preciso em DESI ainda tem que ser comprovada experimentalmente. sensibilidade ¹² DESI é fortemente dependente da solubilidade do analito em solvente do pulverizador, como dessorção depende do microextracção localizada ^13.

Quando usado com uma fase de amostra controlado por software, a amostra é analisada unidireccionalmente com pista pisar debaixo da sonda de ionização de DESI, e através do domínio do tempo, m / z informação é correlacionada com a distribuição espacial da espécie química "(Figura 1). Desde a primeira prova de princípio experimento DESI-MSI relatado por Van Berkel e Kertesz em 2006, ¹⁴ a técnica amadureceu consideravelmente, ¹⁵ com aplicações relatadas na análise de lipídios, ^3,16 metabólitos de drogas, ^17,18 doenbiomarcadores si, ¹⁹ tecido cerebral, ^3,18,20 tecido pulmonar, ^{18 de} tecido do rim, ^{18 de} tecido testicular, ¹⁸ glândulas supra-renais, ¹⁷ placas de cromatografia em camada delgada, ²¹ e superfícies de algas. ²² A resolução rotina de imagens obtidas por DESI-MSI é 100-200 um, que é finalmente determinada pela área de superfície efectiva extraída pelo spray, mas resoluções tão baixo como 40 um foram relatados. ^23-25 ​​Tal resolução e facilitar a análise torna-DESI MSI adequado para a análise rápida e simples de amostras de tecidos biológicos com áreas de superfície na faixa de 0,5-5 cm ^2, permitindo a aquisição de informação espacial valioso para entender melhor os processos biológicos ^26. Aqui, como um exemplo de uma aplicação típica DESI-MSI, vamos rever os detalhes processuais da realização de uma experiência bem sucedida envolvendo imagens de lipídios nos tecidos de cérebro de rato. As duas etapas mais críticas do protocolo são apreparação de tecido ²⁷ e DESI optimização fonte de iões, tal como descrito abaixo.

Protocol

1. Tissue Seccionamento Loja de tecidos flash-congelado, inteiro em freezer -80 ° C até que esteja pronto para o corte. Permitir que a amostra de tecido para atingir a temperatura no cryomicrotome antes de seccionamento (30 min.) Conjunto da lâmina e a temperatura da amostra a -30 ° C. Uma vez que o tecido tenha atingido a temperatura, a manipulação da amostra com uma pinça, corte frontal ou traseira do cérebro, dependendo de qual parte do cérebro é de interesse para montagem em …

Representative Results

A Figura 3 mostra um espectro obtido a partir de um representante secção de cérebro de rato não tratado. No modo positivo, o espectro de massa é dominada por fosfatidilcolinas, devido às suas elevadas eficiências de ionização (atribuído ao grupo amónio quaternário carregado positivamente). A imagem total de iões da secção de tecido é também mostrada na Figura 3, que mostra o sinal abundante em toda a secção do cérebro inteiro. Lípidos chave detectados são identific…

Discussion

A otimização da geometria de origem DESI é fundamental para as experiências bem-sucedidas MSI. As múltiplas variáveis ​​que contribuem para o alinhamento do sistema de afectar directamente a sensibilidade e resolução de imagem. Se durante a optimização, o experimentador tem dificuldades na obtenção do sinal, é recomendável usar mancha vermelha Sharpie desenhada na corrediça, como um valor de referência, o corante, a rodamina 6G, m / z 443, produz um forte sinal no modo de ião positivo e pode ser usa…

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface