Avbildning av biologisk vev ved Desorpsjon Elektrospray Ionization massespektrometri

Summary

Desorpsjon electrospray ionisering massespektrometri (DESI-MS) er en ambient metode der prøvene, inkludert biologisk vev, kan avbildes med minimal prøveopparbeidelse. Ved rastering prøven under ionisering sonde, gir denne spray-basert teknikk tilstrekkelig romlig oppløsning til å skjelne molekylære funksjoner av interesse innenfor vev seksjoner.

Abstract

Massespektrometri imaging (MSI) gir vilkårlige molekylær informasjon med høyest spesifisitet og romlig oppløsning for å undersøke biologiske vev på hundrevis til titalls mikrometer skala. Når arbeidet er utført under vanlige betingelser, blir prøven forbehandling unødvendig, og dermed forenkle den protokoll og samtidig opprettholde den høye kvaliteten på informasjon innhentet. Desorpsjon electrospray ionisering (DESI) er en spray-baserte ambient MSI teknikk som gir mulighet for direkte prøvetaking av overflater i friluft, selv in vivo. Når den brukes med et programvarestyrt prøven stadium, prøven rastered under desi ionisering sonde, og gjennom den tid-domene, er m / z informasjon korreleres med det kjemiske stoff 'romlig fordeling. Den riktighet av desi-MSI utgang er avhengig av kilde orientering og posisjonering i forhold til prøvens overflate og massespektrometer innløp. Heri, gjennomgår vi hvordan å forberede vevsdelene for DESI jegmaging og flere eksperimentelle forhold som direkte påvirker bildekvaliteten. Konkret beskriver vi protokollen for avbildning av rottehjernevev deler av DESI-MSI.

Introduction

Vilkårlige bildebehandling ved massespektrometri forenkler oppkjøpet av kjemisk informasjon for oppdagelse og hypotese-genererende applikasjoner. Målsøkt billeddannende av en kjent kjemisk av interesse, på den annen side, kan lette økt følsomhet og selektivitet gjennom spesifikk metode utvikling. Massespektrometri imaging (MSI) er oftest utført på vev ved hjelp MALDI, ^en sekundær ion massespektrometri (SIMS), ² og ambient ionisering teknikker, inkludert desorpsjon electrospray ionisering (DESI), ³ laser ablasjon-electrospray ionisering (LAESI), ^{4, 5} og væske mikro-junction-overflate prøvetakingssonde (LMJ-SSP). ^6. I MALDI og SIMS, prøvene må fjernes fysisk fra prøven, og må være flat og tynn, slik de blir analysert ved høy-vakuum. MALDI krever belegg av prøven med en stråling-absorberende matrise, og legger til en ekstra og tungvint skritt til prøveopparbeidelse. SIMShar den høyeste lateral oppløsning, men bombardement med svært energiske partikler forårsaker omfattende molekylære fragmentering. Derfor MSI av omgivende metoder fylle en nisje hvor myk analyse med minimal prøveopparbeidelse er ønskelig. Men til dags dato, er alle metoder fremdeles begrenset av kravet om flate prøvenes overflater.

Desi anvender en pneumatisk assistert ladet oppløsningsmiddel spray rettet mot sampeloverflaten å desorbere og ionisere analytter. ^Syv arbeidsmodell for desorpsjon og påfølgende ionisering av Desi er kjent som "dråpe pick-up-modellen". ^8-10 De ladede dråper primære produsert av desi sonde kolliderer med overflaten-, fukte-det og danner en tynn film i hvilken analytten er oppløst ved en faststoff-væske microextraction mekanisme ^8. Etterfølgende dråpe kollisjoner resultat i impulsoverføringen og letting av sekundære dråper som inneholder det materialet ekstrahert fra overflaten . ^9,10 syvende og gassfase ioner antas å bli produsert gjennom ESI-lignende prosesser etter ion fordampning, charge rester modeller eller andre modeller, ¹¹ men den nøyaktige ion dannelsesprosessen i Desi ennå ikke er bevist eksperimentelt. ^12. Desi følsomhet er sterkt avhengig av løseligheten av analytten i spray løsningsmiddel, som desorpsjon er avhengig av den lokaliserte microextraction. ^13.

Når den brukes med et programvarestyrt prøven stadium, prøven er skannet ensrettet med stepping kjørefelt under desi ionisering sonde, og gjennom den tid-domene, er m / z informasjon korreleres med det kjemiske stoff 'romlig fordeling (figur 1). Siden den første bevis på prinsippet DESI-MSI eksperiment rapportert av Van Berkel og Kertesz i 2006, har ¹⁴ teknikken modnet betraktelig, ¹⁵ med rapporterte søknader i analysen av lipider, ^3,16 narkotika metabolitter, ^17,18 diseaSE biomarkører, ¹⁹ hjernevev, ^3,18,20 lungevev, ¹⁸ nyrevevet, ¹⁸ testikkel vev, ¹⁸ binyrene, ¹⁷ tynnskiktkromatografi plater, ²¹ og alger overflater. ^22. Rutinen oppløsningen på bilder fremstilt ved DESI-MSI er 100-200 mikrometer, som er i siste instans bestemt av den effektive arealet trekkes ut av spray, men oppløsninger så lavt som 40 mikrometer er rapportert. ^23-25 ​​Slike oppløsning og enkel analyse gjør DESI-MSI hensiktsmessig for rask og enkel analyse av biologiske vevsprøver med flater i 0,5-5 cm ^a utvalg, slik at anskaffelse av verdifull romlig informasjon for å forstå biologiske prosesser ^26. Her, som et eksempel på en typisk DESI-MSI søknaden, vurderer vi de prosessuelle detaljene for å gjennomføre et vellykket eksperiment med avbildning av lipider i rotte hjernen vev. De to mest kritiske trinnene i protokollen, er detvevspreparat ²⁷ og Desi ionekilde optimalisering, som beskrevet nedenfor.

Protocol

En. Tissue Seksjonering Store flash-frossen, hel vev i -80 ° C fryser til alt er klart for seksjonering. Tillat den vevsprøve for å nå temperaturen i cryomicrotome før snitting (30 min). Sett kniven og prøven temperaturen til -30 ° C. Når vevet har nådd den temperatur, håndtering av prøven med pinsett, skjære-eller baksiden av hjerne avhengig av hvilken del av hjernen som er av interesse for tilstrekkelig monteringsoverflaten (dvs. hvis fronten av hjernen er av primær…

Representative Results

Figur 3 viser et representativt spektrum oppnådd fra en ubehandlet rotte hjerne seksjon. I den positive modus blir massespektrum dominert av fosfatidylcholiner grunn av sin høye effektivitet ionisering (tilskrives den positivt ladede kvaternær ammoniumgruppe). Den totale ion bildet av vevsdeler er også vist i figur 3, som viser rikelig signal på tvers av hele hjernen delen. Viktige lipider detekterte er identifisert i tabell 1 gjennom litteratur sammenligninger. </…

Discussion

Optimalisering av DESI kilde geometri er avgjørende for vellykkede MSI eksperimenter. De mange variabler som bidrar til justering av systemet direkte påvirke følsomhet og oppløsning. Dersom det under optimalisering, har experimenter vanskeligheter med å få signal, anbefaler vi at du bruker rød tusj flekk trukket på lysbildet som en målestokk, fargestoff, rhodamine 6G, m / z 443, gir et sterkt signal i positiv ion modus, og kan brukes til initial optimalisering. I tillegg er løsemiddel seleksjon for Desi avgjø…

Materials

Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura-Finetek	4583	http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile	EMD	AX0156-6	OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome	Thermo Scientific	CryoStar* NX70	Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray;DESI Spray Head	Prosolia Inc.		Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply	Stanford Research Systems, Inc.	PS350/5000V-25W	http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller	Omega		http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview	National Instruments	Version 7.1
Translational stage	Prior Scientific	Optiscan II	http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL	JMS-T100LC	Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface