Fermentorer bruges til at øge kultur udbytte og produktivitet af gensplejsede celler. Efter screening af flere mikrobiel eller animalsk cellekultur kandidater i rystekolber, er det næste logiske trin er at øge den valgte kultur biomasse med fermentoren. Denne video viser opsætningen og driften af en typisk benchtop bioreaktor system.
Gæring systemer anvendes til at tilvejebringe et optimalt vækstmiljø for mange forskellige typer af cellekulturer. Evnen ydes af fermentorer til omhyggeligt at kontrollere temperatur, pH og koncentrationer af opløst oxygen i særdeleshed gør dem afgørende for en effektiv vækst og udtryk af fermentationsprodukterne stor skala. Denne video vil kort beskrive fordelene ved fermentoren over ryste kolben. Det vil også identificere de vigtigste komponenter i en typisk benchtop gæring, og giver grundlæggende instruktion om opsætning af fartøjet og kalibrering af sine sonder. Seeren vil blive fortrolig med steriliseringsprocessen og vist, hvordan man pode vækstmediet i beholderen med kulturen. Grundlæggende begreber i drift, prøveudtagning og høst vil også blive demonstreret. Simpel dataanalyse og systemet oprydning vil også blive drøftet.
Grundlæggende gæring teknologi er en udvidelse af den simple rystekolbe teknik til voksende kulturer. Det voksede ud af et ønske om at styre vækstmiljøer for levende kulturer i en mere komplet og kvantitativ måde. Batch kultur rystekolber er normalt begrænset af upræcis styring af temperaturen. Temperatur ensartethed i en inkuberes shaker eller varmt rum er stærkt varierende, undertiden forvilde 5 ° C eller mere fra den tiltænkte setpunkt. Da rystekolbe normalt omrøres ved en fast hastighed, oxygenoptagelse og gasudveksling er begrænset. Når den tilgængelige omgivende ilt er opbrugt, de fleste kulturer undlader at trives. Der er ingen pH-regulering i rystekolber. I mange tilfælde, hvis kulturen ikke er begrænset af råmateriale, bliver det sure til det punkt skade kulturen og respiration bremser dramatisk. De fleste rystekolbekulturer også køres som en "batch", hvilket betyder, at de bliver fodret én gang ved eller nær ved begyndelsen af kulturerne inoculation. Efter denne indledende carbonkilde er forbrugt, kulturen stopper med at vokse. I nogle tilfælde dets metabolisme kan ændre og begynde at forbruge andre metabolitter i dyrkningsmediet, undertiden ændre karakteristika resulterende biomasse eller protein. Rystekolber er også normalt omfattet medier fordampningstab i varmere kultur miljøer, typisk 10% af volumen pr 24 timer ved 37 ° C. Dette tab ændrer kulturens densitet og forbyder længere tids drift af systemet. Endelig kan brugeren støde skumdannelse fra medierne efter omrøring. Forekomsten af skum i luftrummet over kulturen vil begrænse gas udveksling og yderligere vækst knæ.
Den grundlæggende gæring system er designet til at løse alle disse begrænsninger. Omhyggelig temperaturregulering opnås i fermenteringsbeholdere ved anvendelse af løbehjulet omrøring og en varmekappe. En sensor indsat i skibet og feedback kontrol af opvarmning og afkøling af denne jakke normaltresultater i temperaturkontrol ± 0,1 ° C omkring indstillingspunktet. Stationære fermentorer generelt give styring af pH via flydende reagens tilsætning gennem en pumpe. PH-værdien overvåges kontinuerligt i et forsøg på at holde miljøet optimale for cellevækst. Korrekt beluftning opretholdes ved den førnævnte blanding pumpehjul eller ved infusion af luft eller oxygen suppleres gas direkte ind i kulturen. Med shear-følsomme kulturer, ilt suppleret gas er den primære mekanisme til opretholdelse af ilt-niveau i kulturen. Måling af ilt i opløsning opnås sædvanligvis ved en polarografisk probe, som normalt ikke er til rådighed til brug i rystekolber. Det er også muligt at kontinuerligt eller periodisk tilføje foder til fartøjet for at fastholde væksten i en lineær eller eksponentiel måde. Udgangen gaskondensator giver en kold overflade for damp i udstødningsgasstrømmen at kondensere, og dermed bevare kultur volumen og tæthed. Periodisk tilsætning af antiskummiddel overfladeaktivt aktiveredeved konduktivitetssonden i kultur, reducere skum på overfladen og tillader gasudveksling.
Skibet, med alle prober, fittings, skovlhjul, høst rør og slanger, er samlet og steriliseres i en standard autoklave. Efter den endelige sonde kalibreringer og stabilisering til driftsmiljøet, er kulturen sættes til beholderen. Systemet kan derefter anvendes til at karakterisere kultur på en måde, der er mere kvantitativ og præcis end med en rystekolbe metode. Stram styring af temperatur, pH, iltindhold, foderforbrug, flydende inddampning og skumniveauer alle bidrage til en meget højere biomasse og bedre proteinudbytte.
Tankomrøring bioreaktorer er standarden i den bioteknologiske industri og har været brugt i over 40 år 1. Den lille tankreaktor har været vigtigt for opskalering, skala-down, stamme optimering, karakterisering og procesudvikling. Det kan også have en vigtig rolle i udviklingen af individualiseret medicin 2. Den lille skala bioreaktor er mest ligner in situ-betingelser for cellevækst, fordi det kan overvåges og optimeres gennem en løbetur. Oftest er de første eksperimenter udført ved hjælp rysteflasker men betingelserne i den lille skala bioreaktor adskiller sig væsentligt fra rystekolben. I et eksperiment fandt vi, at betingelserne for optimal vækst af E. coli og fremstilling af grønt fluorescerende protein (GFP) i rystekolbe ikke oversætte til den omrørte beholder (upublicerede data).
Andre metoder til voksende celler i stor skala omfatter rulleflasker, enkelt uSE vippeplatform bioreaktorer 3 og større engangsbrug bioreaktorer med arbejder mængder fra 50 til 5.000 L. Hver metode giver udfordringer for opskalering, men har fundet et sted i produktionen. Engangsbrug vippeplatform bioreaktor svarer til den omrørte beholder, og giver en reguleret miljø. Den adskiller sig fra den omrørte beholder i denne blanding opstår på grund af en vippende bevægelse til at generere bølger for at forhindre celle-bundfældning og give iltning. Hydrodynamikken for metoden er forskellige fra den omrørte tank og maksimalt volumen er begrænset til 1,000 L. Forskellene kan påvirke cellevækst og produktproduktion. Andre engangsbrug systemer kombinerer den omrørte tank med den disponible reaktor at give en platform med et minimum af infrastruktur og tilhørende overhead, og evnen til high-throughput bioforarbejdning 4.
Nye brugere af stationære Bioreaktorer kan have problemer med at bestemme første programmeringer for pH, pO 2 og temperatur, men offentliggjort forskning kan refereres til denne information 5, 6, 7, 8, 9. Med bakteriekulturer især anbefales det at starte omrøring ved den samme hastighed som rystekolbe og temperaturen på samme nominelle værdi. Culture pH fra tidligere rystekolber kørsler kan også anvendes som et udgangspunkt. Indstilling af Po 2 værdi er sværere og bestemmes typisk empirisk. Men der begynder med 50% pO 2 er en anbefalet udgangspunkt.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt var støtte i en del af Johns Hopkins University, Kontoret for Provost gennem Gateway Science Initiative.
Name | Company | Catalog Number |
LB broth | Sigma | L3022 |
ampicillin | Sigma | A1593-25G |
LB broth | Sigma | L3022 |
antifoam 204 | Sigma | A8311 |
1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |