Manuel Isolering af Adipose-afledte stamceller fra humane Lipoaspirates
Summary
I 2001 forskere ved UCLA beskrev isolering af en population af voksne stamceller, der betegnes adipøst afledte stamceller eller ASCs fra fedtvæv. Denne artikel beskriver isoleringen af ASC'er fra lipoaspirates ved hjælp af en manual, enzymatisk fordøjelse protokol hjælp collagenase.
Abstract
I 2001 forskere ved University of California, Los Angeles, beskrev isoleringen af en ny population af voksne stamceller fra liposuctioned fedtvæv, der betegnes de oprindeligt Forarbejdet Lipoaspirate Celler eller PLA celler. Siden da har disse stamceller blevet omdøbt Adipose stamceller eller ASCs og har gået på at blive en af de mest populære voksne stamceller populationer inden for stamcelleforskning og regenerativ medicin. Tusindvis af artikler nu beskriver anvendelsen af ASC'er i en række regenerative dyremodeller, herunder knogleregenerering, perifer nerve reparation og hjerte-kar-teknik. Nylige artikler er begyndt at beskrive det utal af anvendelser ASC'er i klinikken. Det er vist i denne artikel protokol beskriver grundlæggende fremgangsmåde for manuelt, og enzymatisk isolere ASC'er fra store mængder af lipoaspirates opnået fra kosmetiske procedurer. Denne protokol kan nemt skaleres op eller ned for at accommodspiste mængde lipoaspirate og kan tilpasses til at isolere ASC'er fra fedtvæv opnået ved abdominoplasties og lignende procedurer.
Introduction
I 2001 blev en formodet population af multipotente stamceller fra fedtvæv er beskrevet i tidsskriftet Tissue Engineering 1. Disse celler blev givet navnet Forarbejdet Lipoaspirate eller PLA celler på grund af deres afledning af forarbejdet lipoaspirate væv opnået gennem kosmetisk kirurgi. Det beskrives i denne artikel isolation metode var baseret på eksisterende enzymatiske strategier for isolation af stroma vaskulære fraktion (SVF) fra fedtvæv 2. Den SVF er blevet defineret som et minimalt forarbejdet population af røde blodlegemer, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytter og præ-adipocytter, der endnu ikke at overholde en vævskultur substrat 2, 3. Dyrkning af denne SVF tiden foreslås at fjerne mange af disse kontaminerende cellepopulationer og resultere i en vedhængende, fibroblast befolkning. Disse fibroblaster er blevet identificeret i litteraturen for de sidste 40 år som værende pre-adipocytter. Vores forskergruppe viste imidlertid, at disse celler besad mesodermal multipotency og omdøbt den vedhængende SVF befolkningen som PLA celler. Efterfølgende undersøgelser af utallige andre forskergrupper har føjet til dette potentiale, hvilket tyder på både endodermalt og ektodermal potentialer (for en oversigt, se 4). Siden da har mange yderligere vilkår for disse celler dukkede op i litteraturen. For at give en vis form for enighed, blev udtrykket Adipose stamceller eller ASCs vedtaget på nd årlige IFATS konference 2.. Som sådan vil udtrykket ASC bruges i denne artikel.
Det beskrives i denne artikel protokol er en forholdsvis enkel procedure, der kræver standard laboratorieudstyr og bruger enkle reagenser, såsom fosfor saltvand, standard vævsdyrkningsmedier reagenser og collagenase. Det kan producere store antal af ASC'er afhængigt af mængden af udgangsmateriale fedtvæv volumen og efterfølgende cULTUR tid. Behandlingen af en så stor mængde af fedtvæv kan dog præsentere nogle fysiske problemer, der kan mindskes til en vis grad ved hjælp af denne protokol. Hertil kommer, at denne protokol kræver sterile vævskultur faciliteter og godkendte biosikkerhed emhætter og derved nødvendiggør brugen af en godkendt vævskultur facilitet. Dette krav kan også mindske nytten af ASC befolkning i kliniske anvendelser, medmindre de er isoleret i god fremstillingspraksis (GMP)-godkendte anlæg beregnet til isolering og ekspansion af materialer til klinisk brug. Som et alternativ, ville automatiserede systemer, der kan isolere ASC'er i et lukket system på operationsstuen undgå dette vigtige spørgsmål og give mulighed for øjeblikkelig brug af ASC, uden behov for efterfølgende in vitro ekspansion. Til dato er der seks automatiserede systemer, der er kommercielt tilgængelige til isolering af celler fra humant væv. Disse systemer kan gøre det muligt at isolere enbetydeligt antal ASC'er fra store mængder af fedtvæv umiddelbart efter sin høst. Disse ASCs kunne så blive genindført i patienten for en række regenerative formål uden at patienten nogensinde at skulle forlade operationsstuen. I tillæg til denne protokol, der beskriver manuel isolering af ASCer er en protokol til automatiseret isolation af ASC'er bruger Celution System også givet i en følgesvend artiklen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fedtvæv til isolering af ASC'er kan komme i mange former: fra faste stykker af væv opnået ved resektion eller lipoplasty til mindre stykker opnået enten gennem sprøjte udvinding eller suge-assisteret lipoplasty (dvs. fedtsugning). Hvorvidt flere SVF celler (og dermed ASCs) kan fås fra resekteres eller indsugning adipose prøver er uklart, da modstridende undersøgelser er blevet præsenteret 16, 17. Det er muligt, at begge former af fedtvæv er mere end egnet til isolering af SVF celler og …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at anerkende og takke de yderligere forskning personale, der har bidraget til udviklingen af den beskrevne protokol og dens isolering af ASCer, herunder: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, ph.d., dr Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, ph.d., og Dr. John Fraser, PhD. De præsenterede resultater blev finansieret delvist af forskningsbevillinger fra National Institutes of Health, herunder NIAMS og NIDCR Institutes.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
| Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
| 10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
| Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
| Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
| FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
| 25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
| 100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
| Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
| dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
| L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
| insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
| indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
| TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
| [header] | |||
| Equipment Needed | |||
| Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
| Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
| Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |
Riferimenti
- Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
- Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
- Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
- Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , (2012).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
- Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
- Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
- Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
- Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
- Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
- Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
- Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J., Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
- Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
- Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
- Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user’s guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
- Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
- De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537 (2009).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).
