В 2001 году исследователи из UCLA описано изоляция популяции взрослых стволовых клеток, называется полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, из жировой ткани. В этой статье описываются изоляцию ИСС от lipoaspirates использованием ручной, ферментативный протокол пищеварения с использованием коллагеназы.
В 2001 году исследователи из Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе, описано выделение новой популяции взрослых стволовых клеток из liposuctioned жировой ткани, что они изначально называется, Обработанные липоаспирата клеток или PLA клетки. С тех пор, эти стволовые клетки были переименованы в жировой ткани стволовых клеток или ИСС и пошли дальше, чтобы стать одним из самых популярных групп населения взрослые стволовые клетки в области исследования стволовых клеток и регенеративной медицины. Тысячи статей теперь описано использование ИСС в различных регенеративных животных моделях, в том числе регенерации костной ткани, периферической нервной ремонта и сердечно-сосудистых техники. Последние статьи начали описывают множество применений для ИСС в клинике. Протокол показано в этой статье описывается основная процедура для вручную и ферментативно изоляции ИСС от больших количеств lipoaspirates полученных из косметических процедур. Этот протокол может быть легко масштабируется вверх или вниз для Accommodели объем липоаспирата и могут быть адаптированы, чтобы изолировать ИСС из жировой ткани, полученные через abdominoplasties и других подобных процедур.
В 2001 году предполагаемый население мультипотентными стволовых клеток из жировой ткани была описана в журнале Tissue Engineering 1. Эти клетки получили название Обработано липоаспирата или PLA клетки из-за их выводе из обработанного липоаспирата ткани, полученные с помощью косметической хирургии. Метод изоляции описано в этой статье было основано на существующих ферментативных стратегий изоляции стромальных сосудистой фракции (SVF) от жировой ткани 2. SVF была определена как минимально обработанного населения эритроцитов, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, перицитами и преадипоцитов, которые еще придерживаются культуры ткани подложки 2, 3. Культивирование этого SVF течением времени предлагается устранить многие из этих загрязняющих клеточных популяций и привести к прикрепленной, фибробластов населения. Эти фибробласты были определены в литературе за последние 40 лет, как быть предварительноадипоциты. Тем не менее, наша исследовательская группа показала, что эти клетки обладают мезодермального мультипотентность и переименовал приверженцем SVF население в НОАК клеток. Последующие исследования многих других исследовательских групп добавили к этому потенциалу, предполагая, как энтодермальных и эктодермальные потенциалов (см. обзор 4). С того времени, многочисленные дополнительные условия для этих клеток появились в литературе. В целях обеспечения некоторый тип консенсуса, термин полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС была принята на й ежегодной конференции 2 IFATS. Таким образом, термин ASC будет использоваться в этой статье.
Протокол, описанный в этой статье, относительно простая процедура, которая требует стандартный лабораторного оборудования и использует простые реагенты, такие как фосфо-солевом буфере, стандартных для культивирования тканей СМИ реагентов и коллагеназы. Он может производить большое количество ИСС в зависимости от количества исходного объема ткани жировой и последующее Culture время. Однако обработка такого большого количества жировой ткани может представить некоторые физические проблемы, которые могут быть уменьшены до такой степени, используя этот протокол. Кроме того, этот протокол требует стерильных культуры ткани объектов и утвержденные капюшоны биобезопасности, возникает необходимость использования утвержденного культуры объекте ткани. Это требование может также уменьшить полезность населения ASC в клинической практике, если они не изолированы в надлежащей производственной практики (GMP), одобренные устройства, предназначенные для изоляции и расширения материалов для клинического использования. В качестве альтернативы, автоматизированные системы, которые могут изолировать ИСС в замкнутой системе в операционной избежал бы этого ключевого вопроса и создать условия для немедленного использования ИСС без какой-либо необходимости в последующей экспансии в пробирке. На сегодняшний день существует шесть автоматизированных систем, которые доступны в продаже для выделения клеток из тканей человека. Эти системы могут сделать возможным изолироватьЗначительное число ИСС из большого количества жировой ткани сразу после его урожай. Эти ИСС может затем быть вновь в организм пациента для различных восстановительных целях без пациента покидая операционную. В дополнение к этому протоколу, описывающей ручной изоляцию ИСС, протокол для автоматизированного выделения ИСС использованием Celution система также приведены в сопутствующей статье.
Жировая ткань для выделения ИСС может прийти во многих формах: от цельных кусков ткани, полученных с помощью резекции или липосакции на более мелкие куски, полученных с помощью либо извлечения шприца или всасывания при содействии липосакции (т.е. липосакции). Если больше СФДВ клетк…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность и поблагодарить тех дополнительных научных кадров, которые способствовали развитию описанного протокола и его изоляции ИСС, в том числе: д-р Х. Петер Лоренц, доктор медицинских наук, доктор Хироши Muzuno, доктор медицинских наук, доктор Джерри Хуанг, MD , д-р Адам Кац, доктор медицинских наук, доктор Уильям Футрелл, доктор медицинских наук, доктор Жун Чжан, доктор стоматологии, кандидат наук, доктор Лариса Родригес, доктор медицинских наук, доктор Зени Альфонсо, доктор философии, и д-р Джон Фрейзер, кандидат наук. Результаты, представленные финансировались, в частности, путем исследовательских грантов от Национального института здоровья, в том числе NIAMS и NIDCR институтов.
Reagent | |||
DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) | Mediatech Cellgro | 10-013-CV | with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech Cellgro | 30-002-CI | 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin |
Amphotericin B | Mediatech Cellgro | 30-003-CF | 250 μg/ml amphotericin B |
10X PBS (Phospho-buffered Saline) | Mediatech Cellgro | 25-053-CI | without calcium, without magnesium |
Trypsin/EDTA | Mediatech Cellgro | 20-031-CV | 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA |
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) | Sigma | C2674 | crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid |
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated | Gemini Bioproducts | 100106 | USDA source, heat inactivated |
10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | |
25 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-106 | |
50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-106 | |
100 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-202 | |
150 mm tissue culture dishes | Genesee Scientific | 25-203 | |
500 ml Stericup Filter Units | Millipore | SCGPU05RE | PES membrane, 0.22 μm pore |
Cell strainers | FisherBrand | 22-363-549 | 100 μm nylon mesh |
dexamethasone – water soluble | Sigma | D-2915 | |
L-ascorbic-acid 2 phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate disodium salt | Sigma | G-9422 | also known as glycerophosphate |
insulin | Sigma | I-6634 | made from bovine pancreas |
indomethacin | Sigma | I-7378 | |
apo-transferrin | Sigma | T-4382 | |
TGFβ1 | R&D Systems | 240-B-002 | recombinant human |
Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
Alcian Blue | Sigma | A-5268 | |
Silver nitrate | Sigma | S-0319 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | supplied as a 16 % stock |
[header] | |||
Equipment Needed | |||
Class II A/B Biosafety hood | Thermo Scientific | ensure hood has vacuum lines for aspiration | |
Benchtop centrifuge | Hermle Labnet | Z383 | Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g |
Water bath | Fisher Scientific Isotemp | S52602Q | 5-10L capacity, capable of 37 C |
Automated Pipette Aids | Drummond Pipette Aid XL | 4-000-105 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Forma 310 | direct heat or water jacketed |