אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.
מחקר של תאים בתרבית (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה חשובה לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטות וציוד קונבנציונליות לניתוח במבחנה מתאימות גם ללמוד ממספר גדול של תאים (≥ 10 5) בכמויות בקנה מידת מ"ל (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם הוא נחוץ או רצוי להקטין גודל התרבות כדי להפחית את הצריכה של התאים של ריבית ו / או חומרים כימיים הנדרשים לתרבות שלהם, גירוי, או עיבוד. למרבה הצער, גישות קונבנציונליות אינן תומכות במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות מיקרו בקנה מידה, ואת המערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע הם מורכבות ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 – 2000 תאים) בנפח מיקרו בקנה מידהs (1 – 20 μl). הפלטפורמה מורכבת מסדרה של microcapillaries פיברונקטין מצופה ("תאי זלוף תא"), שבתוכה תרבויות מיקרו בקנה מידה שהוקמה, מתוחזק, והמגורה; התקן דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) לבוש עם "העברה" microcapillaries ("מוקד המרכזי "), שבו תאי מסלולים וריאגנטים ומתאי זלוף; משאבת מזרק דיוק גבוה, אשר סמכויות הובלה של חומרים בין תאי זלוף והמוקד המרכזי; וממשק אלקטרוני המספק שליטה על הובלה של חומרים, שהוא תיאם ואוטומטי באמצעות תסריטים שנקבעו מראש. כדוגמה, השתמשנו בפלטפורמה כדי להקל על מחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים. שימוש בפלטפורמה אפשרה לנו להפחית את הצריכה של תאים ריאגנטים, למזער את שונות ניסוי לניסוי, ומחדש ישירות הידיים על עבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, כמו גם הנגישות שלה ורבגוניות, oפלטפורמת ur צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים, ולהיות שימושית במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים שאינם זמינים בכמויות מוגבלות בלבד.
המחקר של תאים נשמר בתרבות (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה רבת ערך לעקרונות היסוד והמנגנונים מולקולריים השולטים במערכות ביולוגיות מורכבות ועל בריאות אדם. את השיטות המקובלות לתרבות, גירוי, ואוסף של תאים לניתוח, אשר מנצלים צלחות פטרי וצלחות microtiter, נועדו למחקר של אוכלוסיות גדולות של תאים (≥ 10 5) בכרכי תרבות מ"ל בקנה מידה (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם רק כמויות מוגבלות של תאים זמינות (תאים ראשוניים לדוגמה), או אוכלוסיות קטנות של תאים רצויים (לדוגמה, כדי להפחית את התא אל תא השתנות פני האוכלוסייה), או חומרים כימיים הנדרשים הם קשים להשגה או יקר מדי (למשל גורמים מטוהרים תא מופרש). בעיות מסוג זה יכול להיות מטופל בהצלחה על ידי שינוי קנה מידה למטה גודל התרבות, שבו יש לו היתרון נוסף של הפחתת הצריכה של כלחומרים כימיים הנדרשים לניתוח ב1,2 המבחנה. לרוע המזל, ציוד ושיטות קונבנציונליים אינם תומכים במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות בקנה מידת מיקרו והמערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע 3-11 הם מורכבים ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי.
בדו"ח זה, אנו מתארים הרכבה ושימוש בפלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 – 2000 תאים) בכמויות בקנה מידת מיקרו (1 – 20 μl). ארכיטקטורת הפלטפורמה (איור 1) היא מודולרי בעיצוב: קבוצה של פיברונקטין מצופה microcapillaries ("תאי זלוף סלולריים" מודול) משמש כאתר להקמה, תחזוקה, וגירוי של תרבויות מיקרו בקנה מידה; ומיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF ) מכשיר 12,13 לבוש עם "העברה" microcapillaries (מודול "המרכזי רכזת") 14,15 תאי מסלוליםוריאגנטים ומתאי זלוף. DMF מאפשר למשתמש לטפל בנפרד טיפות מרובות בו זמנית ולשנות מחדש או להזמין את המניפולציות (רכבות עיבוד מדגם להגדיר מחדש כלומר) מבלי לשנות את חומרת המכשיר. הגמישות העצומה שלו באה לידי ביטוי בהופעה האחרונה שלה כטכנולוגיה מרכזית במגוון רחב של יישומים, כולל תא תרבות 16,17, מבחני אנזים 18,19, 20,21 immunoassays, ה-DNA ניתוח 22,23, עיבוד חלבון, 24,25 ועיבוד דגימה קליני. 26,27 המוקד המרכזי שלנו מנצל את הגמישות המובנית למכשירי DMF, ומשפר עוד יותר אותו באמצעות תוספת של ממשקי microcapillary, אשר מספק הזדמנות לבצע את משנה של מניפולציות (תרבית תאים לדוגמה) בהיקפי מיוחד מודולים, ולא על המכשיר עצמו. DMF מידור של רכבות עיבוד בדרך זו גם מפשט את התכנון של PLAtform ארכיטקטורה (אין צורך לבנות מכשיר DMF שיכול לבצע את כל פעולות העיבוד) ומאפשר ההתפתחות שלה כפונקציות חדשות נדרשות (פשוט לשלב מודולים חדשים פריפריה בהתאם לצורך). הובלה של תאים ריאגנטים בתוך המוקד המרכזי היא מונע על ידי כוחות חשמלית הנוצרים על ידי הפעלה רציפה של אלקטרודות בתוך מכשיר DMF 13,28; תחבורה ל, מ, ובתוך תאי זלוף הוא מופעל על ידי שינויים בלחץ שנוצרו על ידי מזרק דיוק גבוה משאבה. כל תנועות של נוזלים אלה נשלטים באמצעות ממשק אלקטרוני פשוט ואוטומטי באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש.
כדוגמה מייצגת, אנחנו מדגימים את השימוש בפלטפורמה למחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים (איור 2). ביצוע ניסויים אלה על הפלטפורמה אפשר לנו לעבוד עם מספר קטן של תאים (~ 1,000 לניסיונימצב טל), למזער את שונות ניסוי לניסוי, ריאגנטים לשמר, ומחדש ישירים הידיים על העבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, וכן הנגישות והצדדי שלה, פלטפורמה זו צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים ולהוכיח שימושי במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים הזמינים רק בכמויות מוגבלות.
פיתחנו פלטפורמה אוטומטית פשוטה ותכליתית לתרבית תאים בקנה מידה מייקר ניסויים וגירוי. הפלטפורמה מאפשרת לנו לעבוד עם כמויות קטנות תרבות ואוכלוסיות תאים (1 – 20 μl ו100 – 2,000 תאים, לכל תא); גדלי התרבות יכולים להיות מופחתים עוד יותר באמצעות שימוש בmicrocapillaries של קוטר קטן יותר…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים רונלד פ רנזי ומייקל ס Bartsch על תרומתם לעיצוב והפיתוח של מכשירי DMF ורכזת DMF. מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי מעבדת מחקר בימוי ותכנית פיתוח במעבדות הלאומית Sandia. Sandia היא מעבדה תכנית רבת מנוהלת ומופעלת על ידי חברת Sandia, חברה בת בבעלות מלאה של החברה לוקהיד מרטין, למחלקה הלאומי לביטחון הגרעיני של מנהל האנרגיה האמריקנית תחת חוזה DE-AC04-94AL85000.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |