माइक्रो पैमाने पर सेल उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक बहुमुखी स्वचालित प्लेटफार्म
Summary
हम सूक्ष्म पैमाने पर सेल उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक स्वचालित सेल संस्कृति और पूछताछ के प्लेटफार्म विकसित किया है. मंच की खेती और कोशिकाओं की छोटी आबादी उत्तेजक, और आणविक विश्लेषण के लिए lysates उबरने में सरल, बहुमुखी, और सटीक नियंत्रण प्रदान करता है. मंच अच्छी तरह से कीमती कोशिकाओं और / या अभिकर्मकों उपयोग कि पढ़ाई के लिए अनुकूल है.
Abstract
Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (≥105) in milliliter-scale volumes (≥0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 – 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 – 20 μl). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries (“cell perfusion chambers”), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with “transfer” microcapillaries (“central hub”), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.
Introduction
(इन विट्रो विश्लेषण में) संस्कृति में बनाए रखा कोशिकाओं का अध्ययन जटिल जैविक प्रणालियों और मानव स्वास्थ्य गवर्निंग मौलिक सिद्धांतों और आणविक तंत्र में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है. संस्कृति, उत्तेजना, और पेट्री डिश और microtiter प्लेट का उपयोग जो विश्लेषण के लिए कोशिकाओं, के संग्रह के लिए पारंपरिक तरीकों मिली लीटर पैमाने संस्कृति मात्रा में कोशिकाओं (≥ 10 5) (≥ 0.1 मिलीलीटर) की बड़ी आबादी के अध्ययन के लिए डिजाइन किए गए थे. हालांकि, वहाँ की कोशिकाओं के केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं, जिनमें कई मामलों (जैसे प्राथमिक कोशिकाओं) कर रहे हैं, या कोशिकाओं की छोटी आबादी (जैसे जनसंख्या भर में सेल करने वाली सेल परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए) वांछनीय हैं, या आवश्यक अभिकर्मकों प्राप्त करना कठिन है या बेहद महंगा (जैसे शुद्ध सेल secreted कारकों). इस तरह के मुद्दों को सफलतापूर्वक संस्कृति आकार नीचे स्केलिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जो सभी की खपत को कम करने के अतिरिक्त लाभ हैअभिकर्मकों इन विट्रो विश्लेषण 1,2 में के लिए आवश्यक है. दुर्भाग्य से, परंपरागत उपकरणों और तरीकों सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों और 3-11 बहुत जटिल और सबसे प्रयोगशालाओं द्वारा नियमित प्रयोग के लिए विशेष कर रहे हैं वर्तमान में उपलब्ध microfluidics आधारित स्वचालित प्रणाली के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने में गड़बड़ी का समर्थन नहीं करते.
सूक्ष्म पैमाने संस्करणों में (1 – 20 μl) – इस रिपोर्ट में, हम स्वचालित संस्कृति, उत्तेजना, और कोशिकाओं की छोटी आबादी (2,000 कोशिकाओं 100) की वसूली के लिए एक सरल और बहुमुखी प्रौद्योगिकी मंच के विधानसभा और उपयोग का वर्णन. fibronectin लेपित microcapillaries ("सेल छिड़काव कक्षों" मॉड्यूल) सूक्ष्म पैमाने संस्कृतियों की स्थापना, रखरखाव, और उत्तेजना के लिए साइट के रूप में कार्य करता है का एक सेट है, और एक डिजिटल microfluidics (DMF: मंच वास्तुकला (चित्रा 1) के डिजाइन में मॉड्यूलर है "स्थानांतरण" microcapillaries ("केंद्रीय हब" मॉड्यूल) 14,15 मार्गों कोशिकाओं के साथ outfitted) 12,13 डिवाइसऔर करने के लिए और छिड़काव कक्षों से अभिकर्मकों. DMF उपयोगकर्ता को व्यक्तिगत रूप से एक साथ कई बूंदों को संबोधित करने और डिवाइस हार्डवेयर बदलने के बिना जोड़तोड़ (यानी पुन: कॉन्फ़िगर नमूना प्रसंस्करण गाड़ियों) बदलने के लिए या फिर से ऑर्डर करने के लिए सक्षम बनाता है. अपनी जबरदस्त लचीलापन सेल संस्कृति 16,17, एंजाइम assays के 18,19, immunoassays 20,21, डीएनए विश्लेषण 22,23, प्रोटीन प्रसंस्करण, 24,25 सहित आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला में एक प्रमुख प्रौद्योगिकी के रूप में अपने हाल के उद्भव में स्पष्ट है और नैदानिक नमूना प्रसंस्करण. 26,27 हमारे केंद्रीय हब DMF के उपकरणों के लिए निहित लचीलेपन का लाभ लेता है, और आगे विशेष परिधीय में जोड़तोड़ की एक सबसेट (जैसे सेल संस्कृति) से बाहर ले जाने का अवसर प्रदान करता है जो microcapillary इंटरफेस, के अलावा के माध्यम से यह बढ़ाता है बल्कि DMF डिवाइस पर ही से मॉड्यूल. इस तरह से प्रसंस्करण गाड़ियों की compartmentalization भी पीएलए के डिजाइन सरलtform वास्तुकला (सभी प्रसंस्करण कदम बाहर ले जा सकता है कि एक DMF उपकरण का निर्माण करने की जरूरत नहीं) और नए कार्य के रूप में इसके विकास की सुविधा (केवल आवश्यक के रूप में नए परिधीय मॉड्यूल को एकीकृत) के लिए आवश्यक हैं. केंद्रीय हब के भीतर कोशिकाओं और अभिकर्मकों के परिवहन DMF डिवाइस 13,28 भीतर इलेक्ट्रोड की अनुक्रमिक सक्रियण द्वारा उत्पन्न बलों electrowetting से प्रेरित है, से, परिवहन के लिए, और छिड़काव कक्षों के भीतर एक उच्च परिशुद्धता सिरिंज से उत्पन्न दबाव में परिवर्तन द्वारा संचालित है पंप. इन द्रव आंदोलनों के सभी एक सरल इलेक्ट्रॉनिक इंटरफेस के माध्यम से नियंत्रित और पूर्व निर्धारित स्क्रिप्ट के उपयोग के माध्यम से स्वचालित रहे हैं.
एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम बैक्टीरिया के साथ चुनौती (चित्रा 2) पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हासिल transcriptional प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मंच के उपयोग के प्रदर्शन. मंच पर इन प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए हमें कोशिकाओं की कम संख्या (experimen प्रति ~ 1000 के साथ काम करने के लिए सक्षमताल हालत), प्रयोग करने के लिए प्रयोग परिवर्तनशीलता, संरक्षण अभिकर्मकों, और श्रम हाथों पर फिर से प्रत्यक्ष कम से कम. यह प्रदान करता है कि लाभ, साथ ही इसकी पहुंच और बहुमुखी प्रतिभा को देखते हुए, इस मंच प्रयोगशालाओं और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल पाते हैं और केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं कि कोशिकाओं और उत्तेजनाओं के विश्लेषण की सुविधा में विशेष रूप से उपयोगी साबित करना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सूक्ष्म पैमाने पर सेल संस्कृति और उत्तेजना प्रयोगों के लिए एक सरल और बहुमुखी स्वचालित प्लेटफार्म विकसित किया है. संस्कृति आकार के आगे छोटे व्यास की microcapillaries के उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है, मं?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों DMF उपकरणों और DMF हब का डिजाइन और विकास में उनके योगदान के लिए रोनाल्ड एफ Renzi और माइकल एस BARTSCH धन्यवाद. इस शोध पूरी तरह से Sandia राष्ट्रीय प्रयोगशालाओं में निर्देशित अनुसंधान प्रयोगशाला और विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. Sandia के अनुबंध de-AC04-94AL85000 तहत ऊर्जा के राष्ट्रीय परमाणु सुरक्षा प्रशासन के अमेरिकी विभाग के लिए Sandia निगम, लॉकहीड मार्टिन निगम की एक पूर्ण स्वामित्व वाली सहायक कंपनी, द्वारा प्रबंधित और संचालित एक बहु कार्यक्रम प्रयोगशाला है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
Riferimenti
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