マイクロスケール細胞刺激のための実験のための多目的自動化プラットフォーム
Summary
我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。
Abstract
培養中の細胞（in vitroでの解析で ）の研究では、複雑な生物学的システムに重要な洞察を提供してきました。 in vitroでの解析でするための従来の方法と装置はよくミリリットル規模な量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の多数の研究に適しています。しかしながら、関心および/またはその培養物、刺激、または処理に必要な試薬の細胞の消費を減らすために、培養規模を縮小することが必要または望ましいである多くの例がある。残念なことに、従来のアプローチでは、マイクロスケールの文化を正確かつ再現性のある操作をサポートしていないと、現在利用可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムは、あまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化されます。マイクロスケール体積 – この問題に対処するために、我々は自動化された培養物、刺激し、細胞の小集団（2,000セル100）の回収のためのシンプルかつ汎用性の高い技術プラットフォームを開発したS（1 – 20μL）。 "転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブを装備し、デジタルマイクロフルイディクス（DMF）デバイス、プラットフォームは、マイクロスケール培養物を、確立され維持され、刺激され、その中フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（"細胞灌流チャンバー "）、のセットで構成され"）、および灌流チャンバーからのルート細胞および試薬れ、パワー灌流室と中央ハブの間の材料の輸送高精度シリンジポンプ、れると、材料の輸送を制御でき電子インターフェース、ある調整し、予め決められたスクリプトを介して自動化。例として、細菌によるチャレンジに基づい免疫細胞において誘発転写応答の研究を容易にするために、プラットフォームを使用した。プラットフォームを使用することにより、私たちは、細胞や試薬の消費量を減らす実験ツー実験の変動を最小限にするために有効で、再直接ハンズオン労働。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性、Oを考えるウルプラットフォームは、研究室やさまざまなアプリケーションでの使用を見出す、とだけ数量限定で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。
Introduction
（in vitroでの解析では）文化の中で維持された細胞の研究では、複雑な生物学的システムと人間の健康を支配する基本的な原理と分子メカニズムに貴重な洞察を提供してきました。ペトリ皿とマイクロタイタープレートを利用して分析するための文化、刺激し、細胞の収集のための従来の方法は、ミリリットル規模な文化量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の大規模な集団の研究のために設計されていた。しかし、細胞の限られた量が使用可能な多くのインスタンスが（ 例えば、初代細胞）、または細胞の小集団（ 例えば 、集団全体のセル間のばらつきを低減する）ことが望ましい、または必要な試薬を得ることが困難であるまたは高価（ 例えば精製細胞分泌因子）。このような問題が正常に培養規模を縮小することによって対処することができ、これは、 すべての消費を低減するという利点を有している試薬は、in vitroでの解析1,2 にするために必要。残念なことに、従来の装置および方法は、マイクロスケールの文化や3-11はあまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化され、現在入手可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムの正確で再現性のある操作をサポートしていません。
マイクロスケールのボリュームで（1 – 20μL） – 本稿では、自動化された文化、刺激し、細胞の小集団（2,000細胞100）の回復のためのシンプルで汎用性の高い技術プラットフォームの組み立てと使用を説明します。フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリーが（ "細胞灌流チャンバー"モジュール）マイクロスケール文化の確立、維持、刺激のためのサイトとして機能のセット、およびデジタルマイクロフルイディクス（DMF：プラットフォーム·アーキテクチャ（ 図1）は、設計でモジュール化され"転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブ"モジュール）14,15路線細胞を装備）12,13デバイス灌流チャンバーへとからと試薬。 DMFは、ユーザが個々に、同時に複数の液滴に対応し、デバイスハードウェアを変更することなく操作（ すなわち、再構成試料処理列）を変更または再注文することを可能にする。その驚異的な柔軟性は、細胞培養16,17、酵素アッセイ18,19、20,21イムノアッセイ、DNA分析22,23、タンパク質処理、24,25など、幅広い用途でのキーテクノロジーとしての最近の出現で明らかであるおよび臨床検体処理。26,27地球中心ハブは、DMFデバイスに固有の柔軟性を利用し、さらに特化した周辺装置の操作のサブセット（ 例えば、細胞培養物）を実施する機会を提供微小インタフェースを追加することによってそれを増強するむしろDMFデバイス自体よりもモジュール。このように処理列車の区画もPLAの設計を簡素化TFORMアーキテクチャ（ すべての処理手順を実行することができるDMFデバイスを構築する必要がない）と新しい機能としての進化を促進するには（単に必要に応じて新たな周辺モジュールを統合）が必要です。から、交通機関へ、そして灌流チャンバー内で高精度な注射器で生成された圧力変化によって供給され、中央ハブ内の細胞と試薬の輸送はDMF装置13,28内の電極の逐次的活性化によって生成される力をエレクトロウェッティングにより駆動されるポンプ。これらの流体運動のすべては、単純な電子インターフェースを介して制御され、予め決められたスクリプトを使用して自動化されている。
代表的な例として、細菌によるチャレンジ（ 図2）により誘発された免疫細胞の転写応答の研究のためのプラットフォームの使用を示す。プラットフォーム上でこれらの実験を行うことは、私たちは、細胞の数が少ない（experimen あたり 〜1,000で動作するように有効にTAL条件）、実験·ツー·実験の変動、節約試薬、再直接ハンズオン労力を最小限に抑えます。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性を考えると、このプラットフォームでは、研究室や様々なアプリケーションでの使用を見つけて、限られた量で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、マイクロスケールの細胞培養と刺激実験のためのシンプルで汎用性の高い自動化されたプラットフォームを開発しました。文化サイズがさらに小さい直径のマイクロキャピラリーを使用することにより減少させることができる、プラットフォームは、私たちは小さな文化ボリュームと細胞集団- （ – 20μLと100 2,000細胞、室ごとに1）で動作するようになります。これらのスケ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はDMFデバイスおよびDMFハブの設計と開発への貢献のためにロナルドF.レンツィとマイケルS. BARTSCHに感謝します。この研究は完全にサンディア国立研究所で研究所監督研究開発プログラムによってサポートされていました。サンディア国立研究所は、契約DE-AC04-94AL85000下エネルギー省の国家核安全保障管理局の米国商務省のためサンディア社、ロッキード·マーティン社の完全子会社が管理·運営、マルチプログラム研究室です。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
Riferimenti
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry – Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
