Vi har utviklet en automatisert cellekultur og avhør plattform for mikro-skala celle stimulering eksperimenter. Plattformen tilbyr enkel, allsidig og presis kontroll i pleie og stimulere små populasjoner av celler, og utvinne lysatene for molekylære analyser. Plattformen er godt egnet til studier som bruker edle celler og / eller reagenser.
Studie av celler i kultur (in vitro-analyse) har gitt viktig innsikt i komplekse biologiske systemer. Konvensjonelle metoder og utstyr for in vitro-analyse er godt egnet for å studere av et stort antall celler (≥ 10 5) i milliliter skala volumer (≥ 0,1 ml). Det er imidlertid mange tilfeller hvor det er nødvendig eller ønskelig å skalere ned kultur størrelse for å redusere forbruket av cellene av interesse og / eller reagensene som er nødvendig for deres kultur, stimulering eller prosesseringssystem. Dessverre har konvensjonelle tilnærminger støtter ikke presis og reproduserbar manipulering av mikro-skala kulturer, og de MicroFluidics-baserte automatiserte systemer som er tilgjengelige er for komplekst og spesialisert for rutinemessig bruk av de fleste laboratorier. For å løse dette problemet, har vi utviklet en enkel og allsidig teknologiplattform for automatisert kultur, stimulering, og utvinning av små populasjoner av celler (100 – 2000 celler) i mikro-skala volums (1 – 20 ul). Plattformen består av et sett av fibronektin-belagt microcapillaries ("celle" perfusjon kamre), innen hvilken mikro-skala kulturer er etablert, opprettholdes, og stimuleres, en digital MicroFluidics (DMF)-enhet utstyrt med «overføring» microcapillaries ("sentralt nav "), hvilke ruter celler og reagenser til og fra kamrene, en perfusjon høy presisjon sprøytepumpe, som driver transport av produkter mellom de perfusjon kamre og den sentralt nav, og et elektronisk grensesnitt som gir kontroll over transport av materialer, som er koordineres og automatiseres via forhåndsbestemte skript. Som et eksempel har vi brukt plattformen for å lette studiet av transkripsjons-responser oppnås hos immunceller ved utfordring med bakterier. Bruk av plattformen det mulig for oss å redusere forbruket av celler og reagenser, minimere eksperiment-til-eksperimentet variasjon, og re-direkte hands-on arbeidskraft. Gitt de fordeler som den trygdede, samt dens tilgjengelighet og fleksibilitet, our plattformen skal finne anvendelse i en rekke laboratorier og anvendelsesområder, og vise seg særlig nyttig i å tilrettelegge analyse av celler og stimuli som er tilgjengelige bare i begrensede mengder.
Studiet av cellene holdt i kultur (in vitro-analyse) har gitt uvurderlig innsikt i de grunnleggende prinsipper og molekylære mekanismer som styrer komplekse biologiske systemer og menneskers helse. Den konvensjonelle metoder for kultur, stimulering, og samling av celler for analyse, som utnytter petriskåler og mikrotiterplatene, ble utformet for studier av store populasjoner av celler (≥ 10 5) i milliliter skala kultur volumer (≥ 0,1 ml). Det er imidlertid mange tilfeller hvor bare begrensede mengder av celler er tilgjengelige (f.eks primære celler), eller små grupper av celler er ønskelig (for eksempel for å redusere celle-til-celle variasjon på tvers av populasjonen), eller de nødvendige reagenser er vanskelig å skaffe eller uoverkommelig dyrt (f.eks renset celle-utskilte faktorer). Slike problemer kan være vellykket behandlet ved å skalere ned kultur størrelse, som har den ekstra fordelen av å redusere forbruket av allereagenser som er nødvendig for in vitro-analyse 1,2. Dessverre konvensjonelt utstyr og metoder støtter ikke presis og reproduserbar manipulering av mikro-skala kulturer og MicroFluidics-baserte automatiserte systemer for tiden tilgjengelig 3-11 er for komplekst og spesialisert for rutinemessig bruk av de fleste laboratorier.
I denne rapporten beskriver vi montering og bruk av en enkel og allsidig teknologi plattform for automatisert kultur, stimulering, og gjenvinning av små populasjoner av celler (100 – 2000 celler) i mikro-skala volumer (1-20 ul). Plattformen arkitektur (figur 1) er modulær utforming: et sett med fibronektin-belagt microcapillaries ("celle perfusjon kamre" modul) fungerer som sted for etablering, vedlikehold og stimulering av mikro-skala kulturer, og en digital MicroFluidics (DMF ) 12,13 enhet utstyrt med "overføring" microcapillaries ("sentral hub" modul) 14,15 ruter cellerog reagenser til og fra perfusjon kamre. DMF kan brukeren individuelt rette flere dråper samtidig og til å endre eller endre rekkefølgen på manipulasjoner (dvs. rekonfigurere utvalgets behandling av tog) uten å endre enhetens maskinvare. Sin enorme fleksibilitet er tydelig i sin siste fremvekst som en viktig teknologi i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert cellekultur 16,17, enzymanalyser 18,19, immunoanalyser 20,21, DNA-analyse 22,23, protein behandling, 24,25 og klinisk prøve-behandling. 26,27 Vår sentrale nav utnytter den iboende fleksibiliteten til DMF-enheter, og videre forbedrer den gjennom tilsetning av microcapillary grensesnitt, noe som gir mulighet til å gjennomføre en undergruppe av manipulasjoner (f.eks cellekultur) i spesialiserte perifer moduler, snarere enn på DMF enheten selv. Compartmentalization av behandlingen tog på denne måten forenkler også utformingen av plaTForm arkitektur (ikke nødvendig å bygge en DMF enhet som kan utføre alle prosesstrinn) og tilrettelegger sin utvikling som nye funksjoner som kreves (bare integrere nye perifere moduler etter behov). Transport av celler og reagenser innenfor det sentrale navet er drevet av electrowetting kreftene som genereres ved sekvensiell aktivering av elektrodene innenfor DMF-enheten 13,28, transport til, fra og innenfor de perfusjon kamre er drevet av trykkforandringer som genereres av en høy presisjon sprøyte pumpe. Alle disse flytende bevegelser styres via et enkelt elektronisk grensesnitt og automatisert gjennom bruk av forhåndsdefinerte skript.
Som et representativt eksempel demonstrerer vi bruk av plattformen for studiet av transkripsjons-fremkalte responser i immunceller ved utfordring med bakterier (figur 2). Gjennomføring av disse eksperimentene på plattformen mulig for oss å jobbe med et lite antall celler (~ 1000 per experimental tilstand), minimere eksperiment-til-eksperiment variasjon, bevare reagenser, og re-direkte hands-on arbeidskraft. Gitt de fordeler som det confers, samt dets tilgjengelighet og fleksibilitet, bør denne plattformen finner anvendelse i en rekke laboratorier og applikasjoner og vise seg særlig nyttig i å tilrettelegge analyse av celler og stimuli som er tilgjengelige bare i begrensede mengder.
Vi har utviklet en enkel og allsidig automatisert plattform for mikro-skala cellekultur og stimulering eksperimenter. Plattformen gjør det mulig for oss å jobbe med små kultur volumer og celle populasjoner (1 – 20 mL og 100 – 2000 celler, per kammer); kultur størrelser kan bli ytterligere redusert gjennom bruk av microcapillaries av mindre diameter. Å jobbe i disse skalaene reduserer kostnadene ved rutinemessige undersøkelser og gjør gjennomførbare studier som krever bruk av edle reagenser og / eller ce…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Ronald F. Renzi og Michael S. Bartsch for sine bidrag til design og utvikling av DMF enheter og DMF hub. Denne forskningen var fullt støttet av Laboratory Regi Forskning og utvikling-programmet ved Sandia National Laboratories. Sandia er en multi-program laboratorium administreres og drives av Sandia Corporation, et heleid datterselskap av Lockheed Martin Corporation, for det amerikanske Department of Energy National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-AC04-94AL85000.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |