Vi har utvecklat en automatiserad cellkultur och förhör plattform för mikro-skala experiment cellstimulering. Plattformen erbjuder enkel, mångsidig och exakt styrning odla och stimulera små populationer av celler, och återhämtar lysates för molekylära analyser. Plattformen lämpar sig väl för studier som använder värdefulla celler och / eller reagens.
Studie av celler i odling (in vitro-analys) har gett viktig insikt i komplexa biologiska system. Konventionella metoder och utrustning för in vitro-analys är väl lämpade för att studera ett stort antal celler (≥ 10 5) i milliliter skala volymer (≥ 0,1 ml). Men det finns många fall där det är nödvändigt eller önskvärt att skala ner kulturen storlek för att minska förbrukningen av cellerna av intresse och / eller reagens som krävs för deras kultur, stimulans, eller bearbetning. Tyvärr stöder konventionella metoder inte exakt och reproducerbar manipulation av mikro-skala kulturer, och de microfluidicsen-baserade automatiserade system som för närvarande finns tillgängliga är alltför komplex och specialiserad för rutinmässig användning av de flesta laboratorier. För att lösa detta problem, har vi utvecklat en enkel och mångsidig teknologiplattform för automatiserad kultur, stimulans och återvinning av små populationer av celler (100 – 2000 celler) i mikroskala volyms (1 till 20 | il). Plattformen består av en uppsättning fibronektinbelagda mikrokapillärer ("cell perfusionskammare"), inom vilken mikro-skala kulturer upprättas, bevaras och stimuleras, en digital mikrofluidik (DMF)-enhet utrustad med "transfer" mikrokapillärer ("central hub "), som sträckor celler och reagenser till och från perfusionskammare, en hög precision spruta pump, som driver transport av material mellan perfusionskammare och det centrala navet, och ett elektroniskt gränssnitt som ger kontroll över transport av material, vilket är samordnas och automatiseras via förutbestämda skript. Som ett exempel använde vi en plattform för att underlätta studier av transkriptionella de reaktioner i immunceller vid utmaning med bakterier. Användning av plattformen kunde vi minska förbrukningen av celler och reagenser, minimera experiment till experiment variabilitet, och re-direkta praktiska arbete. Med tanke på de fördelar det ger, liksom dess tillgänglighet och mångsidighet, oUR plattform bör finna användning i en mängd olika laboratorier och applikationer, och visa sig särskilt användbara för att underlätta analys av celler och stimuli som finns i begränsade mängder.
Studien av celler hålls i kultur (in vitro-analys) har gett ovärderlig inblick i de grundläggande principerna och molekylära mekanismer som styr komplexa biologiska system och människors hälsa. De konventionella metoderna för odling, stimulans, och insamling av celler för analys, som utnyttjar petriskålar och mikrotiterplattor, var utformade för studier av stora populationer av celler (≥ 10 5) i milliliter skala kulturvolymer (≥ 0,1 ml). Men det finns många fall där endast begränsade mängder celler finns tillgängliga (t.ex. primära celler), eller små populationer av celler är önskvärda (t.ex. för att reducera cell-till-cell variation bland befolkningen), eller erforderliga reagenser är svårt att få eller oöverkomligt dyr (t.ex. renade cell-utsöndrade faktorer). Sådana frågor kan framgångsrikt behandlas genom nedskalning kultur storlek, som har den extra fördelen att minska förbrukningen av allareagenser som krävs för in vitro-analys 1,2. Tyvärr, konventionell utrustning och metoder stöder inte exakt och reproducerbar manipulation av mikro-skala kulturer och de microfluidics-baserade automatiserade system tillgängliga 3-11 är alltför komplex och specialiserad för rutinmässig användning av de flesta laboratorier.
I denna rapport beskriver vi montering och användning av en enkel och mångsidig teknologiplattform för automatiserad kultur, stimulans och återvinning av små populationer av celler (100 – 2000 celler) i mikroskala volymer (1 – 20 pl). Plattformen arkitektur (figur 1) är modulärt uppbyggt: en uppsättning fibronektinbelagda mikrokapillärer ("cell perfusionskammare" modul) tjänar som plats för etablering, underhåll, och stimulering av mikro-skala kulturer, och en digital mikrofluidik (DMF ) 12,13 enheten utrustad med "transfer" mikrokapillärer ("central hub" modul) 14,15 rutter celleroch reagens till och från perfusionskammare. DMF kan användaren individuellt behandla flera droppar samtidigt och att ändra eller åter beställa manipulationer (dvs. konfigurera sampelbehandlingen tåg) utan att ändra enhetens maskinvara. Dess enorma flexibilitet är tydlig i sin växt fram som en viktig teknik i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellodling 16,17, analyser enzym 18,19, immunanalyser 20,21, DNA-analys 22,23, protein bearbetning, 24,25 och kliniskt prov bearbetning. 26,27 Vår centrala navet utnyttjar den flexibilitet inneboende till DMF-enheter, och ytterligare förbättrar det genom tillägg av microcapillary gränssnitt, vilket ger möjlighet att genomföra en delmängd av manipulationer (t.ex. cellodling) i specialiserade perifera moduler, snarare än på DMF själva enheten. Uppdelning av bearbetning tåg på detta sätt förenklar också utformningen av PLATForm arkitektur (inget behov av att bygga en DMF enhet som kan utföra alla processteg) och underlättar dess utveckling som nya funktioner krävs (enkelt integrera nya perifera moduler som behövs). Transport av celler och reagenser inom det centrala navet drivs av electrowetting krafter som genereras av sekventiell aktivering av elektroder inom DMF anordningen 13,28, transport till, från och inom perfusionskammare drivs av tryckförändringar som genereras av en hög precision spruta pump. Alla dessa flytande rörelser styrs via ett enkelt elektroniskt gränssnitt och automatiseras genom användning av förutbestämda skript.
Som ett representativt exempel visar vi användning av plattformen för studier av transkriptionella responser framkallade i immunceller vid utmaning med bakterier (figur 2). Att utföra dessa experiment på plattformen möjligt för oss att arbeta med ett litet antal celler (~ 1.000 per experimental skick), minimerar experiment till experiment variabilitet, bevara reagenser, och re-direct praktisk arbetskraft. Med tanke på de fördelar det ger, liksom dess tillgänglighet och mångsidighet, bör denna plattform finner användning i en mängd olika laboratorier och tillämpningar och visa sig särskilt användbara för att underlätta analys av celler och stimuli som finns i begränsade mängder.
Vi har utvecklat en enkel och mångsidig automatiserad plattform för mikro-skala cellodling och experiment stimulering. Plattformen gör det möjligt för oss att arbeta med små kulturvolymer och cellpopulationer (1 – 20 l och 100 – 2.000 celler per kammare), kultur storlekar kan minskas ytterligare genom användning av mikrokapillärer av mindre diameter. Att arbeta på dessa skalor minskar kostnaderna för rutinmässiga undersökningar och gör genomförbara studier som kräver användning av dyrbara reagen…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Ronald F. Renzi och Michael S. Bartsch för deras bidrag till utformning och utveckling av DMF enheter och DMF nav. Denna forskning stöds fullt ut av den Riktade Laboratory Forskning och utveckling programmet vid Sandia National Laboratories. Sandia är en multi-program laboratorium förvaltas och drivs av Sandia Corporation, ett helägt dotterbolag till Lockheed Martin Corporation, för US Department of Energy National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-AC04-94AL85000.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |