Tridimensionale confocale Analisi dei marcatori microglia / macrofagi di polarizzazione in Experimental Brain Injury
Summary
Un modo per acquisire nuove conoscenze nella complessità della risposta infiammatoria del cervello è presentato. Descriviamo protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale per indagare il pattern di co-espressione di marcatori fenotipici microglia / macrofagi in un modello murino di ischemia focale.
Abstract
Dopo l'ictus cerebrale microglia / macrofagi (M / M) sottoposti attivazione rapida con i cambiamenti morfologici e fenotipici drammatici che includono l'espressione di antigeni di superficie innovativi e la produzione di mediatori che si accumulano e mantengono la risposta infiammatoria. Prove emergenti indica che M / M sono cellule altamente plastica che possono assumere classico antinfiammatorio (M2) attivazione pro-infiammatoria (M1) o alternativo dopo danno cerebrale acuto. Tuttavia una caratterizzazione completa di M / M espressione marcatore fenotipo, la loro colocalizzazione e l'evoluzione temporale nel cervello danneggiato è ancora mancante.
Protocolli di immunofluorescenza specificamente colorazione pertinenti marcatori di attivazione M / M possono essere eseguite nel cervello ischemico. Presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza-seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare il pattern di localizzazione e co-espressione di M / M marcatori fenotipici qualiCD11b, CD68, YM1, nel modello murino di ischemia focale indotta da occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (pMCAO). Analisi bidimensionale della zona macchiata rivela che ciascun marcatore è associato un definito M / M morfologia e ha una data localizzazione nella lesione ischemica. Modelli di M / M marcatore fenotipo co-espressione può essere valutata da tridimensionale confocale nella zona ischemica. Le immagini possono essere acquisite nel corso di un volume definito (10 micron asse z e una dimensione 0,23 um passo, corrispondente ad un volume di 180 x 135 x 10 micron) con una modalità di scansione sequenziale per minimizzare gli effetti di spurgo-through della lunghezza d'onda ed evitare sovrapposizioni. Le immagini vengono poi elaborati per ottenere il rendering tridimensionale per mezzo di software Imaris. Vista solida di tre rendering tridimensionale consente la definizione di espressione marcatore in ammassi di cellule. Abbiamo dimostrato che le M / M hanno la capacità di differenziare verso una moltitudine di fenotipi, a seconda della posizione del sito di lesione e time dopo l'infortunio.
Introduction
Dopo il danno cerebrale acuto, microglia stanno rapidamente attivata e sottoposti drammatica morfologica e fenotipica cambia 1-3. Questa risposta intrinseca è associata al reclutamento di macrofagi del sangue nato che migrano nel infortunato 4,5 parenchima cerebrale. Il ruolo della microglia e macrofagi che non sono antigenicamente distinguibili (d'ora in poi denominato M / M) nel trauma cranico è ancora dibattuta. Un numero crescente di studi indicano che, analogamente a quanto descritto per macrofagi periferici, microglia e macrofagi reclutati cervello possono assumere diversi fenotipi i cui estremi conforme a classico pro-infiammatoria tossico (M1) o anti-infiammatoria protettiva (M2) fenotipo. I diversi stati di attivazione, compreso secrezione di fattori pro o anti-infiammatorie, rilascio di molecole neurotrofici e dell'attività lisosomiale sono caratterizzate da un modello specifico di marcatori fenotipici, la cui espressione dipende dal temporaleevoluzione dell'ambiente circostante. La caratterizzazione di questi fenotipi M / M nel cervello danneggiato è ancora scarsa. Abbiamo utilizzato un modello murino consolidata di pMCAo per analizzare l'espressione M / M e l'evoluzione dopo l'ictus. Protocolli di immunofluorescenza basato presentate qui mirano ad ottenere comprensione nella comparsa di specifici marcatori fenotipici M / M, la loro localizzazione e cellulari co-espressione nella zona ischemica. Abbiamo studiato alcune molecole associate diverso stato di attivazione o fenotipo, cioè CD11b, un marker di superficie espressa da leucociti e un indicatore ampiamente usato di M / M di attivazione / reclutamento 6-8, CD68 un marcatore dei lisosomi 6,7 e YM1 un secretoria proteina espressa alternativamente attivati (M2) e macrofagi associati al recupero e funzione di ripristino 9-10.
Quando due marcatori sono espresse dalla stessa cellula, ma in differenti compartimenti subcellulari, solo colocalizzazione non può essere molto informative. In questo caso, l'analisi di coexpression può essere eseguita utilizzando un'unica vista in pianta e rendering tridimensionali. Siamo qui descriviamo un protocollo per ottenere un'approfondita analisi tridimensionale del marcatore coexpression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo qui protocolli basati immunofluorescenza, seguita da analisi confocale tridimensionale come un approccio efficace per indagare la localizzazione e la co-espressione di M / M marcatori fenotipici nella zona ischemica (per un'analisi più dettagliata vedi rif 6). Questo metodo combina colorazione specifica pertinente marker di attivazione M / M con confocale tridimensionale. La messa a punto di anticorpi, siero e fluorconjugated diluizioni di lavoro permette di segnale ottimale rumore dei mar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stefano Fumagalli è un collega della Fondazione Monzino.
Materials
| Materials | |||
| Rat Anti-mouse CD11b | Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy | ||
| Rat Anti-mouse CD68 | AbD Serotec | MCA 1957 | |
| Rabbit Anti-mouse Ym1 | Stem Cell Technologies | 1404 | |
| Hoechst 33342 | Life technologies | H21492 | |
| Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN) | CHEMICON | MAB377 | |
| Biotinilated Goat Anti-Rat antibody | Jackson Immuno Research | 112-065-143 | |
| TSA Cyanine 5 System | Perkin Elmer | NEL705A001KT | |
| Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Anti-rat alexa 546 | Invitrogen | A-11081 | |
| Anti mouse Alexa 488 | Invitrogen | A-21121 | |
| Anti-rabbit Alexa 594 | Invitrogen | A-11037 | |
| Normal Goat Serum | Vectors Laboratories | S-1000 | |
| Tritin X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417-100 | |
| Equipment | |||
| Cryostat CM1850 | Leica | ||
| Olympus IX81 confocal microscope | Olympus | ||
| AnalySIS software | Olympus | ||
| Imaris software 5.0 | Bitplane | ||
| Photoshop cs2 | Adobe Systems | ||
| Software packages GraphPad Prism version 4.0 | GraphPad Software Inc. |
Riferimenti
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