Permeabilization של תאים דבקו שימוש בגז אינרטי Jet
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לpermeabilization הזמני של תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי. טכניקה זו מאפשרת ההעברה של חומר וביומולקולות גנטיים לתאי יונקים חסיד על ידי הניצול של כוחות מכאניים כדי לשבש את קרום הפלזמה.
Abstract
טכניקות transfection התא שונות קיימות ואלה יכולים להיות מחולקים לשלוש קטגוריות רחבות: ויראלי, כימי ומכאני. פרוטוקול זה מתאר שיטה מכאנית לpermeabilize temporally תאים חסיד באמצעות סילון גז אינרטי שיכול להקל על העברת בדרך כלל מקרומולקולות שאינן חדירות לתאים. אנו מאמינים כי טכניקה זו עובדת על ידי הקניית כוחות גזירה על קרום הפלזמה של תאים חסיד, וכתוצאה מכך היווצרות הזמנית של micropores. ברגע שהנקבוביות הללו נוצרו, התאים ולאחר מכן חדירים לחומר גנטי וביומולקולות אחרת. הכוחות מכאניים המעורבים אין להפעיל את הסיכון של תאים באופן קבוע מזיקים או ניתוק מהמצע שלהם. יש, אם כן, טווח צר של דינמיקת גז אינרטי בי הטכניקה היא יעילה. סילון גז אינרטי הוכיח יעיל בpermeabilizing שורות תאים חסיד שונות, כולל הלה, HEK293 ותאי האנדותל של אב העורקים בבטן אנושי. פרוטוקול זה הוא מתאים לעמermeabilization של תאים חסיד הן במבחנה, כפי שכבר הוכיחו, in vivo, מראה שהוא עשוי לשמש למחקר ופוטנציאלי ביישומים קליניים בעתיד. כמו כן, יש את היתרון של permeabilizing תאים בצורה מרחבית מגבילה, אשר יכול להוכיח להיות כלי מחקר חשוב.
Introduction
עם ההתפתחות של ביו וההבנה של מכניקת תא, המשלוח של ביומולקולות לתוך תאים הפך להיות חיוני לתחומי מחקר רבים וטיפולים רפואיים. טכניקות שונות פותחו כדי להציג את המולקולות זרות דרך קרום הפלזמה ולתוך cytosol התא. יכולים בדרך כלל להיות מסווגים אלה כמו גם: טכניקות ויראלי, כימיים או מכאניות. טכניקות ויראלי יכולות transfect חומר גנטי כמו רנ"א ודנ"א באמצעות וקטורים ויראליים 1. טכניקות ויראלי נוטות להיות בעלי יעילות גבוהה בשורות תאים מסוימות, עם זאת יש להם את הפוטנציאל לתגובות חיסוניים ודלקתיות 2 הם. שיטות transfection הכימי נפוצות כוללות משקעים סידן פוספט 3, exotoxins חיידקי 4 וlipofection 5. טכניקות אלו הוכחו כיעילים, אך בעיות מסוימות מתעוררות כגון רעיל לתא ושאינו ספציפי. יתר על כן, בטכניקות כגון פוספט סידןממטרים דואר כבר נמצאו יעילות transfection עד 70% אלא רק בשורות תאים מסוימות, רק לעתים נדירות בתאים ראשוניים 6. זה ראוי לציון כמו מאמצי מחקר הגדלת מתבצעים הכניסו לתוך תאים ראשוניים, במיוחד במקרה של עיצוב טיפולים שונים לשימוש קליני והמחקר של תפקוד ה-DNA.
שיבוש זמני של קרום התא באמצעות גירויים מכאניים הוא חלופי להחדרת מולקולות זרות לתוך תאים. טכניקות כוללות: microinjection של מולקולות 7, electroporation באמצעות שדה חשמלי כדי לשבש את הקרום 8,9, sonoporation באמצעות גלי אולטרסאונד כדי לשבש את קרום התא 10-12, הפצצת חלקיקים כפי שהודגם על ידי "אקדח הגן", שיורה בחלקיקים קשורים עם גנים לתוך התא 13, ולאחרונה, את היישום של מתח גזירה נוזל שהוכח permeabilize temporally תאי יונקים 14,15. למרות שמכונאישיטות אל חלק מהנושאים הנ"ל להימנע, הם מלווים בדרך כלל על ידי יעילות והגדרות מאוד מורכבות ומיוחדות יותר. לפיד אטמוספרי הפרשות זוהרים לחץ (APGD-t) פותח במקגיל עם המטרה הראשונית של functionalizing משטחים וניתוק תאים חסיד במבחנה 16. דרך מקרה, התגלה כי כתם חי / מת בשימוש היה איכשהו שנלקח על ידי תאים מבלי שהוסיף סוכן permeabilizing. יתר על כן, זה נראה שהתרחש רק באזורים המוגבלים של הבארות שקרתה לי להתאים את נתיב הלפיד. חקירת יכולות permeabilization של APGD-t המשיכה במחקרים בקרה, נמצא כי סילון גז אינרטי הספק של הפלזמה ללא עירור היה גם מסוגל permeabilize תאים. זאת בניגוד להשערה הראשונית כי המינים תגובתי נוצרו על ידי סילון הפלזמה באופן זמני לקוי תפקוד הקרום והציעה שפשוט mechaniכוחות קאל היו מספיקים כדי לגרום permeabilization תא. מכאן, המשך לימודים במעבדה שלנו כדי לנסות ולכמת ולאפיין את יעילות permeabilization של סילון גז אינרטי, כמו גם מבט על יכולות transfection 16.
באמצעות מחקרים אלה, זה כבר גילה כי micropores לעשות בצורת עובדה בקרום הפלזמה, ונקבובי אלה נוטים לאטום בתוך כ 5 שניות 15. אנחנו הוכיחו התועלת של הטכניקה במבחנה in vivo בקרום chorioallantoic של עובר אפרוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
permeabilization סילון גז אינרטי הוא טכניקה שימושית עבור transfection תא חסיד. הוא מספק את היכולת להעביר ביומולקולות לתוך תאים תוך השימוש בכוחות מכאניים, שמבטל את הצורך בכימיקלים מזיקים או וקטורים ויראליים. הטכניקה שעלול לתת לחוקרים וקלינאים דרך יעילה ופשוטה יחסית לtransfect בדיוק ת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למקורות המימון הבאים: מכון קנדי לבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Riferimenti
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
