Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet
Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de tijdelijke permeabilisatie van hechtende cellen met een inert gas jet. Deze techniek bevordert de overdracht van genetisch materiaal en biomoleculen in hechtende zoogdiercellen door het gebruik van mechanische krachten op het plasmamembraan verstoren.
Abstract
Verschillende celtransfectie technieken bestaan en deze kunnen worden onderverdeeld in drie grote categorieën: virale, chemische en mechanische. Dit protocol beschrijft een mechanische methode om tijdelijk doorlaatbaar hechtende cellen met een inerte gasstroom die de overdracht van gewoonlijk ondoorlaatbare macromoleculen in cellen kan vergemakkelijken. Wij geloven dat deze techniek werkt door het meegeven van schuifkrachten op het plasmamembraan van hechtende cellen, waardoor de tijdelijke vorming van microporiën. Zodra deze poriën worden gecreëerd, de cellen worden vervolgens doorlaatbaar voor genetisch materiaal en andere biomoleculen. De mechanische krachten betrokken hebben, lopen het risico van blijvend beschadigen of losmaken cellen van hun substraat. Er is dus een beperkt aantal inert gas dynamiek waar deze techniek effectief is. Een inert gas jet is efficiënt gebleken bij permeabilizing verschillende hechtende cellijnen waaronder HeLa, HEK293 en menselijke abdominale aorta endotheelcellen. Dit protocol is geschikt voor de permeabilization van hechtende cellen zowel in vitro en, zoals aangetoond in vivo laten zien kan worden gebruikt voor onderzoek en mogelijk toekomstige klinische toepassingen. Het heeft ook het voordeel van permeabilisatie cellen in een ruimtelijk restrictief, waardoor zeer waardevol onderzoeksinstrument zijn.
Introduction
Met de evolutie van de medische biologie en het begrip van cel mechanica, is de levering van biomoleculen in cellen van vitaal belang voor vele onderzoeksgebieden en medische therapieën. Verschillende technieken zijn ontwikkeld om vreemde moleculen te introduceren door het plasmamembraan en de cel cytosol. Deze kunnen in het algemeen worden geclassificeerd als: virale, chemische of mechanische technieken. Virale technieken genetisch materiaal transfecteren zoals RNA en DNA onder toepassing van virale vectoren 1. Virale technieken hebben de neiging om een hoog rendement behalen in bepaalde cellijnen, maar ze hebben wel het potentieel voor immuun-en ontstekingsreacties 2. Gebruikelijke chemische transfectie werkwijzen omvatten precipitatie met calciumfosfaat 3, bacteriële exotoxinen 4 en 5 lipofectie. Deze technieken hebben bewezen effectief te zijn, maar ook problemen zoals toxiciteit cel en niet specifiek. Bovendien technieken zoals calcium Phosphate precipitatie gevonden transfectie efficiënties tot 70% maar alleen in bepaalde cellijnen, primaire cellen zelden 6. Dit is opmerkelijk het verhogen onderzoeksinspanningen worden in primaire cellen brengen, met name bij het ontwerpen van verschillende behandelingen voor klinisch gebruik en de studie van DNA functioneren.
Tijdelijke verstoring van het celmembraan door mechanische stimuli is een alternatief voor het inbrengen van vreemde moleculen in cellen. Technieken omvatten: micro-injectie van moleculen 7, elektroporatie met behulp van een elektrisch veld aan het membraan 8,9 verstoren, sonoporatie met ultrasone golven aan het celmembraan 10-12, met deeltjes verstoren zoals blijkt uit de "gene gun", welke deeltjes gebonden met scheuten genen in de cel 13, en meer recent, de toepassing van vloeistofschuifspanning die is getoond om tijdelijk doorlaatbaar zoogdiercellen 14,15. Hoewel monteural methoden voorkomen dat sommige van de bovengenoemde onderwerpen, zijn ze meestal gepaard met een lagere efficiëntie en zeer complexe en gespecialiseerde instellingen. Een atmosferische druk glimontlading fakkel (APGD-t) is ontwikkeld aan de McGill met het oorspronkelijke doel van functionaliserende oppervlakken en losmaken hechtende cellen in vitro 16. Vanzelf werd ontdekt dat een levende / dode vlek gebruikt werd ergens in genomen door cellen zonder permeabilisatie middel toegevoegd. Bovendien, dit leek te hebben plaatsgevonden alleen in gebieden van de putten, die toevallig overeenkomen met de fakkel pad beperkt. Onderzoek naar de permeabilisatie mogelijkheden van de APGD-t voortgezet en controle studies bleek dat de drager inert gas straal van het plasma zonder excitatie was ook in staat om cellen te permeabiliseren. Deze tegenspraak met de eerste hypothese dat de reactieve stoffen die door het plasma jet tijdelijk verminderde het membraan functie en suggereerde dat gewoon de mechanischecal krachten waren voldoende om cel permeabilisatie veroorzaken. Vanaf hier studies verder in ons lab om te proberen en te kwantificeren en karakteriseren van de permeabilisatie efficiëntie van een inert gas jet evenals blik op de transfectie mogelijkheden 16.
Door deze studies is gebleken dat microporiën daadwerkelijk deel in het plasmamembraan en deze poriën vaak sluit op ongeveer 5 sec 15. We hebben bruikbaarheid van de techniek in vitro en in vivo in het chorioallantoïsmembraan van een kippenembryo aangetoond.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inert gas jet permeabilization is een nuttige techniek voor het aanhangend celtransfectie. Het biedt de mogelijkheid om biomoleculen overdracht in cellen met behulp van mechanische krachten, waardoor de behoefte aan potentieel schadelijke chemicaliën of virale vectoren elimineert. De techniek zou kunnen geven onderzoekers en werkers een efficiënte en relatief eenvoudige wijze nauwkeurig te transfecteren. De selectiviteit van de permeabilisatie is ook uniek voor onderzoekers die slechts bepaalde cellen behandeld met ee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de volgende financieringsbronnen bedanken: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Riferimenti
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
