एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पालन कोशिकाओं के permeabilization
Summary
इस प्रोटोकॉल एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं के अस्थायी permeabilization के लिए एक विधि का वर्णन करता है. इस तकनीक प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करने के लिए यांत्रिक बलों के उपयोग के द्वारा पक्षपाती स्तनधारी कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री और biomolecules के हस्तांतरण की सुविधा.
Abstract
विभिन्न सेल अभिकर्मक तकनीक मौजूद हैं और इन तीन व्यापक श्रेणियों के लिए नीचे टूट सकता है: वायरल, रासायनिक और यांत्रिक. इस प्रोटोकॉल अस्थायी कोशिकाओं में सामान्य रूप से गैर पारगम्य बड़े अणुओं के हस्तांतरण की सुविधा कर सकते हैं कि एक आभ्यांतरिक गैस विमान का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं permeabilize करने के लिए एक यांत्रिक विधि का वर्णन करता है. हम इस तकनीक micropores के अस्थायी गठन में जिसके परिणामस्वरूप, पक्षपाती कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर कतरनी बलों प्रदान करके काम करता है विश्वास. इन छिद्रों से बनाया जाता है एक बार, कोशिकाओं तो आनुवंशिक सामग्री और अन्य biomolecules के लिए प्रवेश के योग्य हैं. शामिल यांत्रिक बलों उनके सब्सट्रेट से स्थायी रूप से हानिकारक या detaching कोशिकाओं के जोखिम को चलाते है. तकनीक कारगर है जहां अक्रिय गैस गतिशीलता का एक संकीर्ण सीमा है, इसलिए वहाँ है. एक आभ्यांतरिक गैस जेट हेला, HEK293 और मानव उदर महाधमनी endothelial कोशिकाओं सहित विभिन्न पक्षपाती सेल लाइनों permeabilizing में कुशल साबित कर दी है. इस प्रोटोकॉल पी के लिए उपयुक्त हैहम इसे भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों में संभावित अनुसंधान और के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, दिखा vivo में, प्रदर्शन किया है के रूप में इन विट्रो में और, दोनों पक्षपाती कोशिकाओं की ermeabilization. यह भी एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण साबित हो सकता है, जो एक spatially प्रतिबंधात्मक ढंग से कोशिकाओं permeabilizing का लाभ दिया है.
Introduction
बायोमेडिसिन के विकास और सेल यांत्रिकी की समझ के साथ, कोशिकाओं में biomolecules के वितरण में कई अनुसंधान क्षेत्रों और चिकित्सा उपचार के लिए महत्वपूर्ण बन गया है. विभिन्न तकनीकों प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से और सेल cytosol में विदेशी अणुओं को पेश करने के लिए विकसित किया गया है. वायरल, रासायनिक या यांत्रिक तकनीक: ये आम तौर पर या तो के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है. वायरल तकनीक जैसे वायरल वैक्टर 1 का उपयोग आरएनए और डीएनए के रूप में आनुवंशिक सामग्री transfect कर सकते हैं. वायरल तकनीक हालांकि वे प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 2 के लिए क्षमता है, कुछ सेल लाइनों में उच्च क्षमता हो जाते हैं. आम रासायनिक अभिकर्मक तरीकों कैल्शियम फॉस्फेट 3, बैक्टीरियल exotoxins 4 और lipofection 5 के साथ वर्षा शामिल हैं. इन तकनीकों में प्रभावी होना सिद्ध कर दिया है, लेकिन, कुछ समस्याओं जैसे सेल विषाक्तता और गैर विशिष्टता के रूप में उत्पन्न होती हैं. इसके अलावा, जैसे कैल्शियम phosphat के रूप में तकनीकई तेज़ी शायद ही कभी प्राथमिक कोशिकाओं 6 में, 70% करने के लिए, लेकिन केवल कुछ सेल लाइनों में अभिकर्मक क्षमता है पाया गया है. बढ़ती अनुसंधान प्रयासों विशेष रूप से चिकित्सीय उपयोग और डीएनए कामकाज का अध्ययन के लिए विभिन्न उपचार के डिजाइन के मामले में, प्राथमिक कोशिकाओं में रखा जा रहा है के रूप में इस नोट की है.
यांत्रिक उत्तेजनाओं के माध्यम से कोशिका झिल्ली के अस्थायी व्यवधान कोशिकाओं में विदेशी अणुओं शुरू करने के लिए एक विकल्प है. तकनीकों में शामिल हैं: अणुओं 7 के microinjection, झिल्ली 8,9 बाधित करने के लिए एक बिजली के क्षेत्र का उपयोग कर electroporation, sonoporation के साथ ही कणों गोली मारता है जो "जीन बंदूक" ने प्रदर्शन के रूप में कोशिका झिल्ली 10-12, कण बमबारी को बाधित करने के लिए अल्ट्रासाउंड तरंगों का उपयोग सेल 13 में जीन, और अधिक हाल ही में, अस्थायी स्तनधारी कोशिकाओं 14,15 permeabilize दिखाया गया है कि द्रव कतरनी तनाव के आवेदन. हालांकि मैकेनिकअल तरीकों aforementioned मुद्दों में से कुछ से बचने, वे आम तौर पर कम क्षमता और बहुत जटिल और विशेष setups के साथ कर रहे हैं. एक वायुमंडलीय दबाव चमक निर्वहन मशाल (APGD टी) सतहों functionalizing और इन विट्रो 16 में पक्षपाती कोशिकाओं detaching का प्रारंभिक लक्ष्य के साथ मैकगिल में विकसित किया गया था. Serendipitously, यह प्रयोग किया जा रहा एक लाइव / मृत दाग किसी तरह एक permeabilizing एजेंट जोड़ा जा रहा है बिना कोशिकाओं से लिया जा रहा था की खोज की गई थी. इसके अलावा, यह केवल मशाल पथ के साथ मैच करने के लिए हुआ है, जो वेल्स के प्रतिबंधित क्षेत्रों में हुई है लग रहा था. APGD आयकर की permeabilization क्षमताओं में जांच जारी रखा और नियंत्रण के अध्ययन में, यह उत्तेजना के बिना प्लाज्मा के वाहक अक्रिय गैस जेट भी कोशिकाओं permeabilize करने में सक्षम था कि पाया गया था. यह प्लाज्मा जेट द्वारा बनाई गई प्रतिक्रियाशील प्रजातियों अस्थायी रूप से झिल्ली समारोह बिगड़ा कि प्रारंभिक परिकल्पना का खण्डन किया और सुझाव दिया बस mechani किसीएएल बलों सेल permeabilization पैदा करने के लिए पर्याप्त थे. यहाँ से, पढ़ाई कोशिश करते हैं और यों और permeabilization एक आभ्यांतरिक गैस जेट की दक्षता के साथ ही इसकी अभिकर्मक क्षमताओं 16 पर नज़र चिह्नित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में जारी रखा.
इन अध्ययनों के माध्यम से, यह micropores प्लाज्मा झिल्ली में तथ्य के रूप में करते पाया गया है कि, और इन छिद्रों से लगभग 5 सेकंड 15 के भीतर reseal करने के लिए करते हैं. हम एक लड़की भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली में इन विट्रो में और vivo में तकनीक की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
अक्रिय गैस जेट permeabilization पक्षपाती सेल अभिकर्मक के लिए एक उपयोगी तकनीक है. यह संभवतः हानिकारक रसायनों या वायरल वैक्टर के लिए की आवश्यकता समाप्त जो यांत्रिक बलों के उपयोग के साथ कोशिकाओं में biomolecules हस्तांतर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC): लेखक निम्न धन स्रोतों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Riferimenti
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